[发明专利]对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用。

背景技术

玉米（Zea mays）是世界上种植面积最大并且产量最大的禾本科作物之一，大多用于动物饲料，食物以及工业原料，在工农业中均有着广泛的应用。玉米对于现代社会的发展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白质中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的α醇溶蛋白（22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白）的赖氨酸和色氨酸严重缺乏，导致玉米本身的营养价值较差，长期以玉米为单一粮食会导致严重的营养不良。为了改进玉米的蛋白质质量，人们进行了大量的科学研究。

Opaque-2是一个含有bZIP结构域的转录因子，并且在1987年被人们通过转座子标签技术克隆。Opaque-2突变体表现出了典型的粉质胚乳（图1），并且在生化成分含量中，o2相对于野生型籽粒表现出了高含量的赖氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是一个著名的籽粒高赖氨酸突变体。目前研究表明，转录因子Opaque-2在玉米胚乳中专一的调控22kD醇溶蛋白的表达，并且部分调控19kD醇溶蛋白的表达。由于之前的研究中已经发现，Opaque-2可以和一些非醇溶蛋白产生物理结合，因此，可以认为，Opaque-2在玉米籽粒发育过程中可能还担负着一些其他的重要使命。从Opaque-2克隆至今，人们通过一些方法找到了一些疑似和Opaque-2有关的基因，如：PBF、OHP1、GCN5，但是对于Opaque-2在玉米籽粒发育中具体的调控机制依然不为人知。

鉴于Opaque-2本身转录因子的分子结构以及其调控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人们普遍认为Opaque-2是一个在籽粒发育中起到重要作用的转录因子。解释Opaque-2的具体功能对于人们改进玉米蛋白质品质具有极为重要的意义。根据之前研究的经验来看，通过蛋白相互作用的方法在转录后水平来寻找调控Opaque-2的蛋白不失为一个重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母双杂筛库、体外的Pull-down、体内的免疫共沉淀（CoIP）等。

酵母双杂实验是基于酵母体系在酵母体内筛选可能有互作的两个蛋白的方法。该实验可以大范围地筛选可能有直接互作的两个蛋白。但是，其背景信号较高，会有一些假阳性的情况出现。

Pull-down是基于免疫沉淀和Western技术发展来的体外或者半体内来检测蛋白互作的一门技术。该技术通过抗体的特异性吸附以及互作蛋白之间的相互物理性的结合来进行互作验证。该实验方法相对于酵母双杂可以大幅降低背景，但是还是不能完全体内地来验证蛋白互作。

由Pull-down技术发展而来的免疫共沉淀技术可以在体内情况下验证蛋白互作。该技术原理和Pull-down一致，都是利用了免疫沉淀和Western技术来检测蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了内源的组织细胞表达的蛋白。因此，免疫共沉淀的难度更大对抗体的要求更高，但是结果更可靠。

此外，一些其他的实验方法也可以用来进行蛋白互作之后的功能分析。包括亚细胞定位以及蛋白在植物细胞瞬时表达的酶活测定等。

亚细胞定位主要是基于以荧光蛋白为标签的瞬时转化技术。可以通过基因枪对洋葱表皮细胞瞬时转化以及农杆菌侵染烟草表皮细胞或者原生质体等方法来实现对蛋白的亚细胞定位。

在对互作蛋白的功能分析中，采取以GUS为报道基因，荧光素酶为内参通过酶标仪来测定酶活的方法来对互作蛋白的功能分析进行定量检测。

发明内容

本发明的目的之一在于通过酵母双杂技术筛选出了一个对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，称为ZmTaxilin。该基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。

本发明的目的之二在于提供该基因的克隆方法。

本发明的目的之三在于提供其应用价值。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案为：

一种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

一种克隆上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将均一化的玉米籽粒cDNA片段与单杂载体pGADT7-Rec连接转化，构建饵质粒，选取其中包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域O2-2片段，将其连入pGBKT7载体中，构建库质粒；