[发明专利]一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是真核细胞中发现的一类有调控功能的非编码RNA，通常大约有20～25个核苷酸。miRNAs是由较长的含有hairpin结构的前体经过Dicer酶的剪切加工形成的，随后与RNA诱导的沉默复合体(miRISCs)结合，并通过碱基互补配对识别相应的信使RNA(mRNA)。由于互补程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA阻遏靶mRNA的翻译。miRNA在动植物中有广泛表达，参与细胞增殖凋亡、发育、病毒防御、造血、器官形成、脂肪代谢等多种调节过程。miRNA具有保守性，特异性和时序性，只在特定的细胞和组织中表达，因此决定了细胞和组织功能的特异性。区别于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA3’端为羟基，5’端有一个磷酸基。目前，miRNA的功能仅被部分阐明，近年来，有报道miRNA与细胞癌变具有密切关联。miRNA的功能类似于癌基因或抑癌基因，有些miRNA会协同行使癌基因的功能，使一些凋亡蛋白受到抑制而另外一些miRNA在正常组织中高表达，它们的缺失或低表达可以导致细胞的转化和一些癌基因的激活。因此，miRNA可以作为一个重要的肿瘤标识物，针对miRNA的检测对于早期诊断和愈后诊断有重要意义，同时也为其功能研究提供重要依据。

miRNA由于同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前的miRNA检测方法仍然以传统的Northern Blot为主，依赖于转印迹与杂交。这种方法主要的缺点在于工作流程长，操作复杂，费时，同时需要的样本量大，灵敏度有限，而且探针需要放射性或碱性磷酸酶等标记，这些都产生环境污染与资源浪费。近年发展了一些新的检测方法。芯片技术的发展为高通量检测及筛选带来重大突破，芯片的应用结合不同标记包括碱性磷酸酶，荧光标记，量子点纳米金等，提供了多种信号放大的途径，大大提高了检测的灵敏度。但是芯片及各种标记法均带来检测成本的提高。随后，分子信标的应用为miRNA的检测带来了新的途径，但是在检测miRNA的应用中由于miRNA长度的限制，使得分子信标环状区的长度局限于20-25个碱基左右，因而往往无法完全打开茎秆区而仅产生较低信号，同时分子信标荧光的产生只能是线性扩增，放大倍数不高。随后，RT-PCR的应用，滚环扩增，恒温指数扩增等均发展用来检测miRNA，这些方法各有优势，但是复杂的标记及探针设计，仪器的要求等仍然限制着它们的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种miRNA检测探针和高灵敏低成本检测miRNA的方法。

本发明是基于G-四链体与血红素Hemin形成的复合物具有过氧化物酶活性，催化底物2，2′联氮双(3′-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)被过氧化氢氧化，产生绿色产物。

本发明的探针在靶标miRNA存在的条件下被双链特异性内切酶的酶切后释放出G-四链体形成序列，在钠钾离子及Hemin的共同作用下形成有过氧化物酶活性的复合物，对过氧化氢催化底物ABTS反应，产生绿色产物。此过程可肉眼观察，从而实现miRNA的可视化检测。工作原理如图1所示。

为实现上述目的，本发明所提供的检测探针如下：

一种miRNA检测探针，包括三个部分：靠近3′端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标互补序列，5′端为干扰序列；

所述G-四链体形成序列含有4段GGG序列参与G-四链体形成；

所述待测靶标互补序列为loop环，与相应的靶miRNA完全互补；

所述干扰序列有5-10个与G-四链体形成序列互补的碱基。

所述G-四链体形成序列在非工作条件下，与干扰序列互补配对而不形成G4，整个探针为hairpin结构。仅当有待测靶标存在时，hairpin结构打开，在双链特异内切酶的作用下，G4序列被释放出来形成四链体结构，产生过氧化物酶活性。