[发明专利]一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法

权利要求书

1.一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法，通过以下步骤实现：

（a）设计YPS1的5’端同源臂以及3’端同源臂扩增引物，并从毕赤酵母基因组中有效扩增出这两个同源臂序列；其中用于扩增YPS1 5’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’-aagcctgcag agctccattg cgccaacccc-3’，划线部分为PstⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.2：5’-cggcgtcgac aatctggctg agcggaaagt ttga-3’，划线部分为SalⅠ酶切位点，

用于扩增YPS1 3’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’-cccagatctc acatttcgcg cctgccttcc t-3’， 划线部分为BglⅡ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.4：5’-aaactgcagg ggtgagcctg tctggccct-3’，划线部分为PstⅠ酶切位点；

（b）将步骤（a）中得到的这两个同源臂序列按照先后顺序插入到载体pPICZαB中，获得用于后续同源重组的重组载体pPICZαB-YPS1△，序列为SEQ ID NO.12；

（c）将步骤（b）中构建的重组载体用单一限制性内切酶酶切后转染SMD1168，用含有Zeocin的选择压力的培养筛选重组子，用相应的阳性引物和阴性引物验证同源重组的正确性，正确的缺陷型重组子记为SMD1168 yps1△；其中阴性引物序列为：5’-ctc ctt cca ccg cca cgg c-3’，5’- acc act tga ggc gtc ctt gga-3’，阳性引物序列为SEQ ID NO.7：5’- atg gag gag ttg agg acc -3’，5’- gca aat ggc att ctg aca tcc-3’；

（d）利用步骤（c）中得到的蛋白酶缺陷型宿主SMD1168 yps1△表达相应的蛋白水解酶敏感型重组蛋白—人血清白蛋白-人甲状旁腺激素1-34融合蛋白，SEQ ID NO:13为该融合蛋白的基因和蛋白质序列。

2.根据权利要求1所述的一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法，其特征在于，步骤(a)中，提供了YPS1 5’端同源臂的基因序列SEQ ID NO.9，YPS1 3’端同源臂的基因序列SEQ ID NO.10以及编码yapsin 1的基因序列YPS1 SEQ ID NO.11。

3.根据权利要求1所述的一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法，其特征在于，步骤(b)中，酵母宿主GS115，SMD1168和表达载体pPICZαB从Invitrogen Corp.San Diego.California. USA公司购得。

4.根据权利要求1所述的方法制备获得的人血清白蛋白-人甲状旁腺激素在制备治疗骨质疏松药物中的应用。