[发明专利]一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法

说明书

技术领域

本发明涉及林木育种中胚性材料的保存方法，具体涉及一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法。

背景技术

在林木体细胞胚胎发生和植株再生体系中，培养材料中的胚性细胞是否能较长时间保持旺盛的分和植株再生能力也是林木体胚产业化的重要瓶颈。目前，还没有较好的用于保存胚性材料的方法，常用的就是低温保藏，这种方法虽然简单，但是保存时间短，而且细胞恢复困难，增殖能力低，根本不能长期保存。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，以实现胚性材料长期保存并能使其保持高频增殖能力。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，包括以下步骤：

（1）取待保存的胚性材料，按10%的接种量接入高渗液体培养基，25℃，培养3~10d；其中，高渗液体培养基为添加有0.1~0.8mg/L山梨醇的M13基本培养基；

（2）过滤步骤（1）预培养的胚性材料，装入冷冻管，向冷冻管中加入复合玻璃化保护剂，0℃，放置脱水0～70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存；复合玻璃化保护剂为添加30%甘油和30%乙二醇的M13基本培养基；

（3）从液氮中取出冷冻盒，迅速将冷冻管置于35~43℃水浴中，快速化冻2min；吸去复合玻璃化保护剂，向冷冻管加入1mL的高渗愈伤增殖培养基，停留2min，数次重复洗涤；高渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.5M蔗糖的M13基本培养基；

（4）把洗涤后的胚性材料迅速转移到垫有滤纸的高渗愈伤增殖培养基，25℃，培养1~6d； 

（5）转胚性材料至低渗愈伤增殖培养基上培养1~6d，长出新的愈伤组织，然后转移到愈伤增殖培养基上进行培养；低渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.4M蔗糖的M13基本培养基；

（6）转移长有新的愈伤组织的胚性材料至体胚诱导培养基上培养，直至高频体细胞胚胎发生即可。

步骤（1）中，培养6~8d。

步骤（1）中，在所述的高渗液体培养基中还加有1~5mg/L ABA和50~200mg/L脯氨酸。

步骤（2）中，所述的放置脱水，为先用60% PVS2保护胚性材料过渡脱水0~10min，然后转到100% PVS脱水0~60min，然后再投入液氮保存。

步骤（3）中，37℃水浴。

步骤（3）中，高渗愈伤增殖培养基为添加0.6mol/L山梨醇的M13基本培养基。

步骤（4）中，蔗糖浓度为0.4M，培养2d。

步骤（5）中，蔗糖浓度为0.3M，培养5d。

步骤（6）中，培养3个月，就可以实现高频体细胞胚胎发生。

有益效果：与现有技术相比，本发明的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，操作简单，方便可行，解决了林木体胚产业化的重要瓶颈问题，可实现胚性材料长期保存到2年以上，并能使其保持高频增殖能力，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是预培养渗透剂浓度试验结果图；

图2是预培养时间试验结果图；

图3是不同温度进行细胞复苏结果图；

图4是胚性悬浮细胞复苏结果图；

图5是可溶性淀粉在恢复培养中的作用结果图；图中，A、B为恢复5d时的状态，C、D为恢复25d时的状态；

图6是ABA对细胞存活的影响结果图；

图7是山梨醇处理后内源脯氨酸的变化结果图；

图8是外源脯氨酸对细胞的保护作用结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下实施例的胚性材料为杂种马褂木胚性悬浮细胞，其培养方法同中国专利申请02112948.7或201010298850.6。M13基本培养基的配方为：MS+2，4-D 2.0mg/L+6，BA0.2mg/L+LH 500mg/L +蔗糖 30g/L，pH值为5.8。

实施例1