[发明专利]焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

吉非替尼(Gefitinib)(商品名：Iressa易瑞沙)是2003年美国FDA批准的第二个信号转导抑制剂，主要用于治疗既往接受过化学治疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。厄洛替尼(Erlotinib)(商品名：Tareeva特罗凯)于2004年通过美国FDA审批在美国上市，作为二线或三线药物用于治疗晚期或其他方案无效的非小细胞肺癌患者。埃克替尼（Icotinib）（商品名：Conmana，凯美钠）是我国食品药品监督管理局（SFDA）于2011年6月8日批准上市的小分子肿瘤靶向治疗药物，主要用于非小细胞肺癌的治疗。三者为同类药物，其作用靶点均为人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor family，EGFR）。在体内主要是同三磷酸腺苷竞争性地与EGFR细胞内酪氨酸激酶结合域结合，选择性抑制EGFR相关的活性及细胞内磷酸化过程来发挥其抗肿瘤作用，通过对EGFR酪氨酸激酶活性的抑制，阻滞下游信号转导通路，拮抗血管生成、细胞迁移扩散及增殖作用，阻断肿瘤组织的生长。

上述三种EGFR酪氨酸激酶抑制药，是目前NSCLC患者最有效的靶向药物。但EGFR-TKI并非对所有患者都有效。EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，吉非替尼有效率可高达80%，而野生型患者基本无效。EGFR敏感突变是药物有效的前提。但部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与EGFR20号外显子突变密切相关。以NSCLC为例，EGFR20号外显子突变发生率为1.6%，约占EGFR突变9%，50%的EGFR-TKI耐药由EGFR20号外显子的T790M点突变所致。

由此可见，对EGFR基因18、19、20和21外显子进行分型检测可预测患者对吉非替尼和埃罗替尼的反应性，为临床医生给非小细胞肺癌初次治疗制定药物治疗方案提供依据，也可以根据20号基因型判断患者是否会产生继发耐药。

综上所述，对EGFR基因18、19、20和21外显子进行分型检测可预测患者对吉非替尼和埃罗替尼的反应性，为临床医生给非小细胞肺癌初次治疗制定药物治疗方案提供依据，也可以根据20号基因型判断患者是否会产生继发耐药。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测EGFR基因多态性的试剂盒将为酪氨酸激酶抑制药的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

EGFR基因多态性是影响酪氨酸激酶抑制剂能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用酪氨酸激酶抑制剂生物标志物的用药基因EGFR多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测酪氨酸激酶抑制剂个体化用药相关基因SNP。

    为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

    EGFR exon18（SEQ ID NO.1）上游引物：5′- GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG-3′（SEQ ID NO.5）；

    EGFR exon19（SEQ ID NO.2）上游引物：5′- AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3′（SEQ ID NO.6）；

    EGFR exon20（SEQ ID NO.3）上游引物：5′- TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3′（SEQ ID NO.7）；

    EGFR exon21（SEQ ID NO.4）上游引物：5′- CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3′（SEQ ID NO.8）；

    EGFR exon18下游引物：5′- TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC-3′（SEQ ID NO.9）；

    EGFR exon19下游引物：5′- CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3′（SEQ ID NO.10）；