[发明专利]用氧结合蛋白提高多杀菌素产生

说明书

优先权要求

本申请要求2011年5月3日提交的美国专利申请序列号13/100,202“用氧结合蛋白提高多杀菌素产生(ENHANCING SPINOSYN PRODUCTION WITH OXYGEN BINDING PROTEINS)”的申请日的权益。

技术领域

本发明用于分子遗传学技术领域，其中可将基因整合至刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的染色体中。一种代谢工程方法包括氧结合蛋白诸如血红蛋白基因在染色体DNA区内的整合和表达，所述整合和表达导致提高的多杀菌素产生，同时不对刺糖多孢菌的生长或者其它期望代谢特征产生负面影响。

背景技术

如美国专利5,362,634所披露，发酵产品A83543是由刺糖多孢菌产生的相关化合物的家族。该家族的已知成员已被称为因子或组分，并且各自给予标识字母代号。这些化合物在下文中称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蜘蛛、线虫和昆虫，具体为鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)物种。这些化合物被认为是环境友好的，具有吸引人的毒理学概貌(toxicological profile)。

天然产生的多杀菌素化合物是由21碳四环内酯组成的大环内酯类，其包括两个脱氧糖的附接：中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福乐糖胺)(参见Kirst等人，(1991)。若不存在所述氨基糖，则将所述化合物称为假甙元A、D(pseudoaglycone of A,D)等；而若不存在所述中性糖，则将所述化合物称为逆假甙元A、D(reverse pseudoaglycone of A,D)等。更优选的命名为将这些假甙元称为多杀菌素A 17-Psa、多杀菌素D 17-Psa等，而将这些逆假甙元称为多杀菌素A 9-Psa、多杀菌素D 9-Psa等。

天然产生的多杀菌素化合物可经发酵由刺糖多孢菌菌株NRRL 18395,18537,18538,18539,18719,18720,18743和18823以及它们衍生物制备。这些培养物已经进行保藏，并成为美国北方农业研究所保藏中心(the Midwest Area Northern Regional Research Center,Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture,1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604)的原种培养物保藏的一部分。

美国专利5,362,634及对应的欧洲专利0375316B1涉及多杀菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。这些化合物据称通过培养选自NRRL 18395、NRRL18537、NRRL 18538和NRRL 18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株产生。

WO 93/09126涉及多杀菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中还讨论了两种产生多杀菌素J的菌株：NRRL 18719和NRRL 18720，以及产生多杀菌素Q,R,S和T的菌株：NRRL 18823。

WO 94/20518和美国专利5,6704,486涉及多杀菌素K、O、P、U、V、W和Y以及它们的衍生物。其中还讨论了产生多杀菌素K的菌株NRRL18743。

产生多杀菌素化合物的挑战来自需要鉴定和验证刺糖多孢菌基因组内的中性位点，其中含有基因表达盒的多核苷酸可进行整合和稳定表达。引入的基因表达盒可含有生物合成基因，该生物合成基因提供一种产生可具有不同的杀虫活性谱的多杀菌素新型衍生物的方法，或者除了会赋予现有的多杀菌素产生菌株新的有益特性的其它基因表达盒之外，还能提高多杀菌素的滴度水平的基因表达盒。

鉴定和引入导致多杀菌素化合物的产生提高的基因会是有利的。

发明内容

本发明涉及将多核苷酸整合至可用于产生杀虫剂的刺糖多孢菌菌种的染色体DNA中的方法，其整合体，以及该整合体的用途。

本发明还提供含有多杀菌素增强基因的遗传修饰的宿主细胞，所述多杀菌素增强基因整合至刺糖多孢菌基因组中，这导致多杀菌素产生的提高。如此，刺糖多孢菌滴度水平导致摇瓶发酵中A/D产生或J/L产生的改善。