[发明专利]成熟油菜次生休眠种子RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取。 

背景技术

RNA提取技术不仅是分子生物学的基本实验技术，也是进行分子生物学研究的必要前提。只有分离得到纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、纯化mRNA以用于蛋白质体外翻译或构建cDNA文库，以及mRNA差异显示、高通量转录组测序等后续的分子生物学研究。

油菜种子属脂肪质种子，含有大量的脂质、蛋白质、多糖、维生素和多酚等物质，严重影响了RNA的提取。因此油菜种子总RNA的提取比较困难，常规的Trizol  Reagent Kit、异硫氰酸胍一步法等已报道的植物组织总RNA提取方法都不适用于油菜种子。目前已有不完全成熟或新鲜的油菜种子RNA提取成功的报道，如华中农业大学的CTAB法（丁勇等.华中农业大学学报.2006，25(5):465-468）、湖南农业大学选用TIANGEN公司裂解液RL并加以优化的方法（严明理等.生物技术通报.2007,6:97-100）等。

然而，我们将上述方法应用于成熟油菜次生休眠（secondary dormancy）种子RNA的提取，在严格控制实验条件情况下却未能获得稳定可靠的提取结果。油菜种子具有显著的次生休眠特性（所谓次生休眠，是指原来不休眠或解除休眠后的种子由于干旱等不适宜环境条件的影响而诱发的休眠），明确油菜种子次生休眠的分子机制，可以为人工调控油菜种子休眠特性提供理论依据。而高质量地提取成熟油菜次生休眠种子的RNA则是研究种子休眠分子机制的重要前提。

抑制内源RNA酶的活性、防止RNA降解是RNA提取的关键技术，特别是在成熟的油菜次生休眠种子RNA提取过程中。因为成熟的油菜种子老健组织部分富含RNA酶，加之种子进入休眠状态后，生理活性大大降低，使得油菜种子RNA的分离效果和完整性都难以保障。而采用已有的新鲜油菜种子或不完全成熟油菜种子RNA提取方法，则存在着试剂消耗量大、提取时间长（1-8.5小时）等缺点，尤其是提取时间过长直接增加了RNA受污染而降解的可能性，并最终导致提取失败。因此，缩短提取时间、抑制内源RNA酶活性、减少与防止RNA降解是成熟油菜次生休眠种子RNA提取的最为核心技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供成熟油菜次生休眠种子高质量RNA的快速提取方法。本发明提供的方案是：选用RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂，通过β-巯基乙醇抑制RNA酶活性、防止酚类物质氧化，应用醋酸钠去除多糖类物质对RNA的影响，并减少抽提次数。按照本方法，完成次生休眠油菜种子RNA的提取仅需30分钟左右，且RNA质量好、纯度高。所述步骤包括：

（1）取0.1g成熟的油菜次生休眠种子放入加有液氮的研钵中，迅速磨成粉末；

（2）将步骤（1）制得的粉末加入含有RNA plant plus植物总RNA提取试剂的离心管，振荡至彻底混匀。室温平放离心管静置，再加入预冷的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，4℃13000rpm离心4-5min；

（3）将步骤（2）制得的上清液转移至新离心管中，加入预冷的醋酸钠和无水乙醇，倒转2-3次混匀后冰上静置，4℃ 13000rpm离心4min，弃上清，乙醇洗沉淀，室温下干燥，用RNase-free  ddH₂O溶解沉淀即得。

优选的，所述步骤（2）中每百毫克油菜种子粉末中加入RNA plant plus  reagent （TIANGEN公司生产，使用前按照体积比1：4加入β-巯基乙醇与RNAplant plus reagent混合）800μl。优选的，所述的步骤（2）中苯酚-氯仿-异戊醇用量为500μl。

优选的，所述的步骤（2）和步骤（3）中的静置时间为5 min。

优选的，所述的步骤（3）中醋酸钠浓度为3mol/L、pH值为5.2，用量为70μl。

优选的，所述的步骤（3）中无水乙醇用量为1400μl。

优选的，所述的步骤（3）中的乙醇洗沉淀为75%乙醇洗涤，洗涤次数为2次。