[发明专利]生物膜的免疫治疗

说明书

发明领域

本发明涉及用于预防或改变诸如那些含有牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生物膜的细菌生物膜的形成和/或发展的组合物与方法。特别是，本发明涉及使用或抑制在生物膜生长期间或在血红素限制下受到调控的多肽来调节生物膜的形成和/或发展。本发明涉及对可以用作抗菌疫苗或免疫治疗/免疫预防基础的多肽的鉴定。

发明背景

许多细菌治疗针对浮游状态的细菌。然而，细菌病理学包括生物膜状态的细菌。例如，牙龈卟啉单胞菌被认为是慢性牙周疾病的主要病因(causative agent)。对在牙齿表面作为多种微生物细菌生物膜的一部分而生长的牙龈卟啉单胞菌的异常调节的宿主免疫应答，导致了与该疾病有关的组织损伤。细菌生物膜在自然界中普遍存在，并且定义为互相粘附和/或粘附至表面或界面的基质围绕(matrix-enclosed)的细菌群落(1)。这些作为成熟的生物膜粘附至表面并在表面上生长的固定细菌细胞能够幸免于包括存在抗微生物剂、剪切力以及营养缺乏在内的不利环境。

疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)估计65%的人细菌感染与生物膜有关。生物膜通常通过保护细菌免受免疫系统、降低抗生素效力并将浮游细胞分散至远处以促使再感染，使慢性感染的治疗复杂化(2、3)。牙菌斑是细菌生物膜的典型实例，其中高多样性的物种形成在牙齿表面生长的异源多微生物生物膜。牙齿的表面是独特的微生物生境，因为牙齿表面是人体中唯一的坚硬、永久、不脱落的表面。与上皮细胞的脱落限制了生物膜的发展的粘膜表面相反，这使得坚固的细菌生物膜在漫长的时间内累积。因此，发生在浮游与生物膜状态之间的牙龈卟啉单胞菌蛋白质组的变化，对我们理解慢性牙周疾病的发展是重要的。

牙龈卟啉单胞菌分为两个大的菌株组，包括W50和W83在内的菌株被描述为在动物模型中是侵入性的，而包括381和ATCC 33277在内的菌株则被描述为非侵入性的(4、5)。Griffen等人(6)发现，W83/W50样菌株比包括381样菌株在内的其他牙龈卟啉单胞菌菌株与人牙周疾病更相关，而Cutler等人(7)证明，牙龈卟啉单胞菌的侵入性菌株比非侵入性菌株对吞噬作用更具抵抗力。测序的牙龈卟啉单胞菌W83菌株与模式菌株ATCC 33277的比较表明，菌株33277缺乏7%的基因或者是高度趋异的(divergent)，这表明菌株之间存在明显的不同(8)。有趣地是，与容易形成生物膜的菌株33277相比，牙龈卟啉单胞菌菌株W50在大部分条件下仅形成不好的生物膜(9)。由于这个原因，对牙龈卟啉单胞菌W50形成生物膜只进行了相对很少的研究。

利用基于凝胶染色强度计算蛋白比率的2D凝胶电泳方法，进行了定量蛋白质组学研究，以测定诸如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及变形链球菌(Streptococcus mutans)的人细菌病原体，从浮游至生物膜状态的蛋白质组的变化(10-12)。替代方案是利用稳定同位素标记技术，例如ICAT、iTRAQ或具有MS定量的重水(H₂¹⁸O)(13)。H₂¹⁸O标记的基础是，在蛋白质水解期间，已证明诸如胰蛋白酶的内肽酶将两个¹⁸O原子并入所得的肽的C-末端(14、15)。除了用于测定相对蛋白丰度以外(16-19)，蛋白质组学中的¹⁸O标记还用于鉴定蛋白C-末端、鉴定酶促移除聚糖后的N-连接的糖基化、简化MS/MS的数据解释以及最近用于证实磷酸化位点(20-23)。用于测量相对蛋白丰度的¹⁶O/¹⁸O蛋白水解标记方法包括将一个样品在H₂¹⁶O中消化，并将另一样品在H₂¹⁸O中消化。然后在通过LC MS/MS进行分析前，将该消化物合并。可以通过测量MS模式中肽离子对(ion pair)的相对信号强度，定量从LC柱中洗脱的肽。将两个¹⁸O并入胰蛋白酶消化的肽的C-末端，导致+4m/z的质量漂移(mass shift)，从而允许鉴定同位素对。