[发明专利]猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪及培育方法无效

专利信息
申请号: 201210135794.3 申请日: 2012-05-04
公开(公告)号: CN102715132A 公开(公告)日: 2012-10-10
发明(设计)人: 赖良学;逄大欣;欧阳红生;任林柱;宋娜;于飞飞;杨鑫;陈福旺;曹宇航;李莉 申请(专利权)人: 吉林大学
主分类号: A01K67/027 分类号: A01K67/027;C12N15/63;C12N5/10
代理公司: 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 代理人: 陈宏伟
地址: 130062 吉*** 国省代码: 吉林;22
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摘要:
搜索关键词: 繁殖 呼吸 综合症 病毒 受体 cd163 培育 方法
【权利要求书】:

1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪,其特征在于:

在敲除猪体内CD163基因不表达。

2.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪的培育方法,包括以下步骤:

1)PRRSV受体CD163基因敲除载体的构建

分别克隆猪CD163基因同源左臂和同源右臂序列,然后将上述同源臂亚克隆至含正向筛选基因Neo和负向筛选基因TK的pSSC-9载体,构建含正负筛选标记的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163;

1.1)用PCR扩增猪的CD163基因同源左臂和同源右臂序列

用同源臂扩增引物分别扩增CD163基因同源左臂和同源右臂序列;

1.2)将CD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接,分别构建成pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163;

1.3)用BamHI和HindIII酶切pGM-T-Sarm-CD163,回收CD163基因同源右臂Sarm片段;用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163,回收CD163基因同源左臂Larm片段;将CD163基因同源左臂与同源右臂先后连接至pSSC-9载体上,构建成含正负筛选标记的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163;

2)CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞系的建立

将上述构建的基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163线性化后,用脂质体法转染到猪胚胎成纤维细胞中,对经抗性筛选获得的阳性细胞进行基因敲除的鉴定,对鉴定确证发生同源重组的细胞冻存;

2.1)载体线性化:提取pSSC-Larm-Sarm-CD163质粒,用Sfi I酶切,然后乙醇沉淀,用无菌ddH2O溶解;

2.2)脂质体转染:将线性化的载体按照脂质体Fugene HD转染小型猪成纤维细胞,5 % CO2,39 ℃培养;

2.3)核供体细胞的获得:用G418筛选8-10天后,获得抗性细胞;采用PCR方法对所获得的细胞进行鉴定,得到CD163基因敲除猪成纤维细胞;该细胞即为核供体细胞;

3)利用体细胞核移植技术构建CD163基因敲除猪

采用体细胞核移植技术,以母猪做代孕母猪,构建CD163基因敲除猪。

3. 根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法,其特征在于:

CD163基因敲除载体为pSSC-Larm-Sarm-CD163,该载体含有CD163基因同源左臂和同源右臂,参见图1。

4. 权利要求2或3所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法,其特征在于:

用于扩增CD163基因同源左臂和同源右臂,引物序列如下:

同源左臂的扩增引物:

PCDE2-3F:5’-ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’, 

PCDE3-4R:5’-ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’;

同源右臂的扩增引物: 

PCDE5-6F:5’-AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3’, 

PCDE5-6R:5’-AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。

5. 权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的PCR鉴定方法,其特征在于,用于基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定的引物序列如下:

鉴定引物对1(JDYW1):

5’-TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’,

5’-AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’;

鉴定引物对2(JDYW2):

5’-AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3’, 

5’-ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’;

鉴定引物对3(NEO1):

5’-TCTGATGCCGCCGTGTT-3’,

5’-GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’;

鉴定引物对4(NEO2):

5’-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’,

5’-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3’。

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