[发明专利]一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法

权利要求书

1.一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，其特征在于由下述步骤组成：

一级种子培养：将配制好的酪酸菌一级种子培养基，分别置于三角瓶A和三角瓶B中，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再取酪酸菌试管斜面菌种，分别接种于上述已灭菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接种时间延迟10-14h;将三角瓶A和B于34-37℃厌氧培养12-16h；即得一级种子A和一级种子B;

二级种子培养：将配制好的酪酸菌二级种子培养基分别置于种子罐A和种子罐B中，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再将步骤①培养好的一级种子A和一级种子B，以5%-10%的接种量分别接种于种子罐A和种子罐B中，其中种子罐B比种子罐A接种时间延迟10-14h，以上种子在34-37℃厌氧培养12-16h，即得二级种子A和二级种子B;培养过程中间歇搅拌；上述各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验；

连续发酵：

a.将配制好的酪酸菌发酵培养基，补料培养基分别置于发酵罐A和发酵罐B及补料罐C、补料罐D中，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃；

b.先将步骤②中培养得到的二级种子A以5%-10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0.02MPa-0.04MPa，在34-37℃厌氧培养20-26h，发酵过程中间歇搅拌；

c.发酵罐A接种培养10-14h后，将步骤②中培养得到的二级种子B以5%-10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0.02MPa-0.04 MPa,在34-37℃厌氧培养10-12h,发酵过程中间歇搅拌；

d.发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使发酵罐A装料系数达到80%为止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使发酵罐B装料系数达到80%为止；

e.当发酵罐A发酵培养20-26h后，将发酵罐A中的培养液以0.084v/h的速度连续放料到离心机中离心，收集菌体；同时将发酵罐B中的培养液以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐B的体积，保持物料的平衡;补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求，以形成补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体；所述的v为发酵罐A的实际装料体积；

f.从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为140-360h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中；

制剂：收集菌体，得湿菌泥，按湿菌泥重量的5%添加保护剂，再按湿泥重量2-5倍比例加入玉米淀粉，混合制粒，置沸腾床内，以氮气为气源进行沸腾干燥，干燥后颗粒经粉碎，过60目筛，得菌粉；再与菌粉重量2-10倍的玉米淀粉混合，即得本发明的酪酸菌制剂成品；要求每克成品中酪酸菌活菌数不少于1.0×10⁹个；

上述步骤中使用的酪酸菌种子培养基、发酵培养基及补料培养基、保护剂的组成分别如下：

    一级种子培养基：葡萄糖2.0%~2.5%、牛肉膏0. 5% ~1.5%、 蛋白胨1.0% ~2.5%、磷酸氢二钾0.02% ~0.05%、氯化钠0.05% ~0.2%、硫酸镁0. 02% ~0.2%、水93%~96.9%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

二级种子培养基:硫酸铵0.4%~0.8% 、葡萄糖2.5%~3.0%、酵母浸膏0. 5% ~1.8%、蛋白胨0.5% ~1.5%、碳酸钙0. 1%~0. 3%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、氯化钠0. 05%~0. 15%、硫酸镁0. 02% ~0.05%、水92.45%~95.7%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

发酵培养基及补料培养基:硫酸铵1.5%~2. 0%、 葡萄糖4.0%~5. 0%、豆粉水解液6.0%~8. 0%、酵母粉0.5% ~1.0%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、硫酸锰0.002% ~0.005%、硫酸镁0. 02%~0.15%、、碳酸钙0. 4%~0. 6%、水81. 45%~90.4%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

保护剂：海藻糖60%、蔗糖38%、维生素C2%；

上述一级、二级种子培养基、发酵培养基及补料培养基，保护剂中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为100%。