[发明专利]斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种rC3B 蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种补体C3蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。

背景技术

补体第三组分(C3)是补体系统的核心 ，它是 1912年 Ritg用蛇毒处理血清时发现的。在补体各成分中， 补体C3 的血清含量最高。补体C3蛋白具有特殊的结构，是一种β2糖蛋白，由α、β两条肽链组成，两肽链间以二硫键相连，分子量为195KDa，其中α链为115KDa，由998个氨基酸残基组成，N末端和C末端均为丝氨酸；β链为75KDa，由669个氨基酸组成，N末端为丝氨酸，C末端为丙氨酸。两链间氢键、疏水键及二硫键相互连接，其中二硫键散在于α链的92-93位氨基酸及β链的11-656位氨基酸之间。C3的激活与灭活酶的作用部位主要在α链，β链则与稳定必要的分子构象有关。在α链的半胱氨酸和谷氨酸残基之间有一个分子内硫酯键，此键不稳定，尤其是对蛋白质和碳水化合物中的亲核基团敏感，如羟基（－OH）和氨基（－NH₂）。C3当被C3转化酶裂解为C3a和C3b时，C3b分子内硫酯键变得更加不稳定，可被附近的羟基或氨基激活，断裂为酰基和巯基。酰基具有较强的亲电性，可与相应膜表面的亲核基团形成酯键或酰氨键，由此C3b结合于相应的膜表面，此结合部位为C3b的不稳定结合部位，借此部位，C3b除可结合于细胞膜表面外，还可结合于相应的免疫复合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上 ，C3 亦居于中心地位 ，它既是3条激活途径的交汇 ，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础;同时 C3 裂解片段及其结合蛋白复杂而多样 。C3分子上存在着众多与其他分子的结合位点，C3通过其上的系列受体位点与补 体其它成分、病原体、血细胞等发生广泛的作用，从而在机体的免疫防御和免疫病理中发挥重要作用。rC3B是C3上与单核细胞、巨噬细胞表面补体受体的结合位点，也就是补体 Ⅲ型受体( CR3，CD1lb／CD18 )结合位 。C3裂解片段通过该结合位点与大量存在于单核细胞、中性粒细胞等上的 C R 3结合，从而促进机体对血液中病原体的吞噬和清除，提高鱼类抗病性，增强鱼类自身的免疫力。

石斑鱼类隶属鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)，为暖水性礁栖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力的饲料添加剂。

酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势：生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用：使用强的可诱导启动子-AOX1基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白的前体蛋白，即石斑鱼补体C3蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆载体。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼补体C3功能片段rC3B重组蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供石斑鱼rC3B蛋白和/或C3蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。