[发明专利]一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，属于免疫学领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DVH）引起的雏鸭一种急性高度致死性传染病，这种病的特点是发病急、病程短、传染快、发病率与死亡率都比较高的疾病，给养殖业带来重大经济损失。

转移因子（TF，Transfer Factor）又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子分子量小、无毒、活性强、无抗原性、不起过敏反应等优点，对于治疗动物病毒性疾病、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤、真菌性疾病时，可以起辅助治疗作用。

尽管目前已经有一些抗鸭病毒性肝炎的药品和制剂，但由于现有的药品制剂针对性不强，疗效有限，而且治疗性的制剂多是在发病之后才应用的，不能起到根本的治疗作用。

目前已报道的转移因子的提取方法大多关于非特异性转移因子的制备方法，而且多是体内转移因子免疫法的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法。

本发明所采用的技术方案如下：一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，以鸡脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子。

本发明制备方法的具体步骤如下：

1）淋巴细胞的制备：首先选择健康鸡，在无菌的条件下采取鸡脾脏或抗凝血，制成单层淋巴细胞；

2）淋巴细胞的培养：淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；

3）病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于9-10日龄鸡胚的尿囊腔内，37℃培养72-120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；

4）转移因子的制备:经过植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，即得抗鸭病毒性肝炎转移因子。

步骤1）所述鸡脾细胞制备过程中胰酶浓度要求0.22-0.25%，pH为7.3-7.6，用量为组织体积量的5-7倍。

步骤4）所述促进鸡脾脏细胞或血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为60-180mg/L。

本发明关于体外制备的抗鸭病毒性肝炎转移因子能够高效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染，达到根本上预防的作用。这种通过传代培养可以生产出大量的产品，出产率高，成本低，可以节约大量的人力、物力，可避免产品携带外援病毒及其他病源微生物。这制备方法具有简单、易操作、生产成本低等特点。

具体实施方式

    结合具体实施例对本发明的内容作进一步的说明。

实施例1

一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，本实施例是以鸡外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子，具体步骤如下：

1.抗凝血的采集：选择健康无传染病鸡，采血部位消毒，用50mL的无菌注射器，心脏采集抗凝血，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL；

2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，3000r/min离心15min，收集中间的白色层；然后用pH7.0的Hanks液反复清洗淋巴细胞4次，5000r/min，离心10min，收集沉淀，用含30%的犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO₂，37℃恒温箱中培养，经2天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层；

3.淋巴细胞的培养：单层淋巴细胞进行传代培养，首先将长成单层淋巴细胞层用0.22%的胰酶37℃短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO₂，37℃恒温培养,每天观察一次，长成单层为止；