[发明专利]百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。 

技术背景

百日咳是由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽并伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声，如未得到及时有效治疗，病程可达数个月。本病传染性很强，患儿年龄越小，病情越重，可因并发肺炎、脑病而死亡。 

百日咳患者是唯一的传染源，从潜伏期末1～2天，至发病后6周内都有传染性，以病初1～3周传染性最强。百日咳患者咳嗽时病原菌随飞沫传播，易感者吸入带菌的飞沫而被感染。人群对百日咳普遍易感，未接种疫苗的婴幼儿尤其易感，儿童集体机构可发生流行。在疫苗接种后，百日咳发病率可发生明显下降，有些国家中断疫苗接种则发病率上升，发展中国家发病率较高。接种疫苗后一般可获数年免疫力。百日咳在全球均有流行和分布，多见于寒带及温带，全年均可发病，冬、春两季高发。 

副百日咳博德特氏菌也可以引起类似百日咳症状的上呼道疾病，但是其引起的症状轻微，易与百日咳博德特氏菌引起的百日咳疾病混淆。因而，快速而准确的实验室鉴别检测方法，对于患者的治疗和易感人群的预防用药尤为重要。病原菌培养是百日咳检测的金标准，其特异性强，但是其敏感性较差，同时存在耗时长的缺点，不适合实验室的快速检测。血清学检测特异性 百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌抗体，常常需要双份血，检测敏感度低，主要用于回顾性诊断或不典型病例的辅助诊断。 

由于缺少特异性的实验室检测手段，只能依靠临床症状进行病例诊断，因而百日咳的发病率可能被低估。本发明针对百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来鉴别检测样品中百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌核酸，可以快速获得特异性检测结果。 

发明内容

为了更加准确地检测样品百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为： 

P1：5`-atcagacccgcggcttcatc-3`， 

P2：5`-gctgcgctgctacttcagctt-3`， 

P3：5`-cgtattcttgacggcaggtatttgac-3`， 

P4：5`-atagccctgccagcctccca-3`。 

P1和P2为针对百日咳博德特氏菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P3和P4为针对副百日咳博德特氏菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。 

本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为： 

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-cagacgagatccagcgctgggcc-Y<sub>1</sub>-3`， 

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-caggagtgcagggagatgctggatc-Y<sub>2</sub>-3`。 

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。Probe1为针对百日咳博德特氏菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对副百日咳博德特氏菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探 针。 

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。 

本发明的一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Ec l ipse。