[发明专利]玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法及检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种玉米内州萎蔫病菌的检测方法，尤其涉及一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测玉米内州萎蔫病菌的引物。

背景技术

棒形杆菌属Clavibacter仅包含一种植物病原菌Clavibacter michiganensis(Cm)，根据其寄主专化性的不同，分为5个亚种，包括玉米内州萎蔫病菌C.m.subsp.nebraskensis（Cmn）、番茄细菌性溃疡病菌C.m.subsp.Michiganenis(Cmm)，马铃薯环腐病菌C.m.subsp.sepedonicus(Cms)，苜蓿萎蔫病菌C.m.subsp.insidiouss(Cmi)，玉米内州萎蔫病菌Cmn和小麦花叶病菌C.m.subsp.tessellarius(Cmt)(Eichenlaub et al.2006)。它们均可引起重要的植物病害，EPPO将Cmm、Cms和Cmi列为检疫性有害生物，而我国将Cmn、Cmm、Cms和Cmi同时列入检疫性有害生物名录。

玉米内州萎蔫病菌Cmn又名密执安棒形杆菌内布拉斯加亚种，隶属于厚壁菌门Firmicutes，厚壁菌纲Firmibacteria，棒型杆菌属Clavibacter。1969年，美国内布拉斯加州首次发现该病菌引起的玉米内州萎蔫病(Goss's bacterial wilt and leaf blight of corn)（Vidaver and Mandel,1974）。至1972年，该病害已扩展至邻近5个州。近年来随着转基因品种的推广，病害蔓延至美国中西部各玉米种植区，包括内布拉斯加州、堪萨斯州、南达科他州、科罗拉多州、怀俄明州、密歇根州、威斯康幸州、爱荷华州、伊利诺斯州、印第安那州（Ruhl et al.2009）、明尼苏达州(Malvick et al.2010)、德科萨斯州(Korus et al.2011)及加拿大安大略省、曼尼托巴省(Agarkova et al.2011)，成为北美地区玉米生产上的严重病害。

玉米内州萎蔫病菌Cmn可危害马齿玉米、甜玉米、硬粒玉米、爆玉米、狗尾草、稗草和甘蔗。Cmn可随种子传播(Biddle et al.1990)，而且我国大部分玉米种植区适合病害发生(陈寔等.2009)。病菌一旦传入定殖，容易暴发造成病害流行，且病害防治难度大。我国玉米产量和种植面积均居世界第二，在国民经济中占有重要地位。2011年，仅饲用玉米我国每年进口量已达数百万吨。因此，病菌传入我国并扩散传播的潜在风险巨大。目前，国内尚未见进境玉米样品中Cmn检测的报道，准确快速实用的微量病菌检测方法具有十分重要的潜在应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一方面，提供一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)设计引物，该引物的序列为：

PSM 1：5’-cctttccgtcgtcctttc-3’（SEQ ID NO.1）或其互补链；

CM3：5’-gcatccaccgtttgctct-3’（SEQ ID NO.2）或其互补链；

(2)玉米样品（或玉米种子样品）中细菌DNA提取；

(3)采用步骤（1）设计的引物进行PCR检测。

步骤（2）中，所述玉米样品中细菌DNA提取具体为：玉米样品混匀后放入PBS缓冲液（PH7.2）中，4℃浸泡过夜；过滤，滤液离心弃上清，沉淀用试剂盒提取DNA。

步骤（3）中，所述PCR检测的反应体系为25μL，包括2.5μL 10×PCRbuffer(Mg²⁺plus)，2.5μL dNTP（各250μM），步骤（1）上下游引物各1μL（100pM）、2μL模板DNA、1.5U Taq聚合酶（5U/μL），加水补至25μL。

步骤（3）中，所述PCR检测的反应程序为：94℃预变性3min；然后以94℃30s，63℃30s，72℃30s扩增35个循环；最后72℃延伸5min。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测玉米内州萎蔫病菌的引物，其序列为：

PSM1：5’-cctttccgtcgtcctttc-3’（SEQ ID NO.1）或其互补链；