[发明专利]Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体及其表达纯化方法

权利要求书

1.一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于：插入的外源序列氮端为Ⅰ型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在Ⅰ型人胶原蛋白上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点以及用于连接Ⅰ型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该Ⅰ型人胶原蛋白-表皮生长因子的氨基酸序列如下：

1        LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT

61       GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD

121      GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV PGDLGAPGPS

181      GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER

241      GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT

301      GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI

361      GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET

421      GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP

481      GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK

541      GDRGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS GDRGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR

601      GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK

661      WWELR

2.根据权利要求1所述的Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于：所述的pPIC9K载体自身α信号肽切割位点氨基酸序列为Lys-Arg-Glu-Ala。

3.根据权利要求1所述的Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于：所述的表皮生长因子的核苷酸序列为：

1       AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC

61      ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG

121     AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA

4.一种权利要求1所述的Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的表达纯化方法，其特征在于它包括下述步骤：

（1）基因的获得

从离体的人胎盘中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计Ⅰ型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ和pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，引物序列为：

F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA

R: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG

采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白基因；

重新设计并合成表皮生长因子的核苷酸序列，添加限制性内切酶酶切位点EcoR Ⅰ及Not Ⅰ和 pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，表皮生长因子的核苷酸序列如下：

1        GAATTCAAAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC

61       TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGAA GCATTGGATA AGTATGCTTG TAACTGTGTT

121      GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA

181      GCGGCCGC

（2）载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白、表皮生长因子的连接

对pPIC9K及Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1；对pPIC9K-COL1质粒与表皮生长因子分别进行EcoRⅠ及NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1-EGF；

该重组DNA序列如下：

1        CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT

61       CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT

121      CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT

181      GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC

241      CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC

301      AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT

361      GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA

421      CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT

481      GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT

541      GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT

601      GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT

661      GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT

721      GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT

781      GATGGCTCTC CTGGCAAAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC

841      CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT

901      GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT

961      GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT

1021     GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT

1081     GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT

1141     ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA

1201     CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT

1261     GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG

1321     AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT

1381     ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT

1441     GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA

1501     CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA

1561     CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG

1621     GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC

1681     CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT

1741     CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT

1801     GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTCAAACGA GAAGCTAATT CTGATTCTGA ATGTCCTTTG

1861     TCCCACGATG GTTACTGCTT GCATGATGGT GTCTGCATGT ATATTGAAGC ATTGGATAAG

1921     TATGCTTGTA ACTGTGTTGT TGGCTACATC GGTGAGAGAT GTCAGTACAG AGACTTGAAG

1981     TGGTGGGAAT TGAGATAAGC GGCCGC

（3）毕赤酵母电转化

将10μg经Sal Ⅰ内切酶线性化的pPIC9K-COL1-EGF质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 ℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；

（4）多拷贝插入重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；

（5）Ⅰ型人胶原蛋白-表皮生长因子的发酵表达

将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30 ℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 ℃，pH 值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH 值为5.5，溶氧控制在20%～30%，流加质量浓度为75%的含12 mL/L PTM1 微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTM1 微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时，在发酵分泌表达出胞外的过程中，切割α信号肽切割位点，切割出Ⅰ型人胶原蛋白、表皮生长因子两种蛋白；

（6）Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化

发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，获得表皮生长因子与Ⅰ型人胶原蛋白混合浓缩液，用分子筛层析分离，分别收集表皮生长因子与Ⅰ型人胶原蛋白，获得表皮生长因子粗蛋白液及Ⅰ型人胶原蛋白粗蛋白液；表皮生长因子粗蛋白液用阴离子交换层析，获得表皮生长因子；Ⅰ型人胶原蛋白粗蛋白液，用阳离子交换层析，获得Ⅰ型人胶原蛋白。