[发明专利]一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌属于高GC含量的革兰氏阳性菌，具有较强的氨基酸和有机酸的合成能力，可以生产多种化学物质，是一种重要的工业微生物。通过基因工程改造的方法调节谷氨酸棒杆菌胞内的代谢网络或者通过代谢工程方法为谷氨酸棒杆菌构建新的代谢途径，可以获得具有高生产强度菌株，其可以生产各种生物物质，如泛酸，木糖醇，海藻糖和聚羟基丁酸脂等。基因工程或代谢工程的基本方法是在加强表达途径中的关键酶基因或者诱导表达新的代谢途径基因。这些基因都是在启动子的调控下表达，其表达强度和调控严谨性依赖于启动子的元件。到目前为止，乳糖诱导表达的启动子及其衍生启动子被广泛应用于谷氨酸棒杆菌。这些启动子在诱导物存在的条件下可以迅速激活启动子的转录，然而它们在谷氨酸棒杆菌中的表达强度低于其在大肠杆菌中的表达强度，而且还有较高水平的本底表达，不能够提供严紧性的调节。研究人员已经通过突变P_tａｃ启动子-10区的核甘酸序列和利用强组成型表达的启动子调节阻遏蛋白的表达的方法，来提高启动子的P_ｔａｃ表达水平和调节的严紧性（Journal of Microbiologly Methods,2010，80，86-92；Plasmid，2010，2，85-91）。但是，由于谷氨酸棒杆菌对诱导剂的渗透能力较低，使得这些启动子的表达水平仍然相对较低。作为诱导剂的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）由于价格较高而且对细胞有潜在的毒性，使其不能够被广泛的应用于工业大规模的蛋白表达或者生物材料的生产。尽管谷氨酸棒杆菌中许多的启动子的调节机制被广泛研究（Journal of Biotechnology，2003，104，287-99；Journal of Biotechnology，2011，90，1641-1654），到目前为止，在谷氨酸棒杆菌中仍缺乏一种可以严谨性调节，高效表达，而且满足工业生产需要的表达载体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD。

上述的DNA片段中，所述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom为序列表中序列1自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列1自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因araC为序列表中序列1自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因启动子P_c为序列表中序列1自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖启动子P_BAD为序列表中序列1自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段。

上述的DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第5239-8046位。

本发明的另一个目的是提供一种表达载体。

本发明提供的表达载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、权利要求1或2所述的DNA片段和转录终止子rrnB。

上述表达载体具体为自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌oripUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD和转录终止子rrnB。

上述的表达载体中，所述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1为序列表中序列1自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；