[发明专利]一种抗短葶山麦冬皂苷C单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗短葶山麦冬皂苷C单克隆抗体的制备，并用于含短葶山麦冬皂苷C中药材及生物样品的含量检测，此方法特别适合于大批量样本中短葶山麦冬皂苷C含量的快速检测，属于生物技术领域。 

背景技术

短葶山麦冬Liriope muscari(Decne.)Baily为百合科山麦冬属植物，具有养阴生津、润肺清心的功能，研究发现其具有跟麦冬类似的治疗心血管系统疾病、降血糖、延缓衰老、调节免疫、抗肿瘤等多种活性。其主要活性成分短葶山麦冬皂苷C(DT13)可明显增强小鼠耐缺氧能力、增强小鼠免疫器官重量、促进弹力廓清速率的作用，其作用强度与人参总皂苷近似。 

针对皂苷类成分的含量测定有多种方法，主要为高效液相色谱法(HPLC)。HPLC的样品前期处理程序复杂，灵敏度不高，耗时较长，难以满足皂苷类成分吸收、代谢等研究。但利用特异性单克隆抗体拥有独特的优点，可以建议快速、高效、灵敏的免疫分析方法，克服上述不利之处。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗短葶山麦冬皂苷C单克隆抗体及基于该单克隆抗体的分析方法。 

产生抗短葶山麦冬皂苷C单克隆抗体的制备方法包括如下步骤： 

1)合成免疫抗原DT13-BSA 

(1)将DT13溶于80％MeOH溶液，于搅拌下逐滴加入0.1M NaIO₄溶液，避光搅拌100min； 

(2)加入1M乙二醇中和反应，搅拌30min离心去沉淀； 

(3)将BSA水溶液逐滴加入反应上清液中，用NaCO₃调pH值至9.0，搅拌反应90min； 

(4)加入NaBH₄溶液，搅拌反应3h后用HCOOH调pH值至6.5，继续搅拌60min； 

(5)用NH₄OH调pH值至8.5，产物溶液4000rpm离心10min，取上清液用双蒸水透析72h，冷冻干燥后于-20℃保存备用。 

采用红外光谱鉴定并通过三硝基苯磺酸法测定载体蛋白偶联的半抗原数。 

2)动物免疫 

选用6～8周龄雌性BALB/C小鼠，首次免疫采用DT13-BSA与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射，剂量为100μg/只；之后每隔两周采用DT13-BSA与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化进行加强免疫，第4次加强免疫后用间接ELISA法测定小鼠血清的抗体效价， 效价在1∶10000以上时进行冲击免疫，准备细胞融合。 

3)细胞融合及阳性克隆筛选 

使用PEG 1450介导免疫脾细胞与SP2/0融合，采用间接ELISA法进行初步筛选，选取阳性孔细胞采用有限稀释法重复克隆化，最终获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

4)单克隆抗体的制备、纯化及其鉴定 

选用BALB/C经产雌性鼠进行腹腔注射杂交瘤细胞，收集小鼠腹水，首先采用辛酸-硫酸铵淀法初步纯化，然后采用Protein A亲和层析柱进一步纯化，所得抗体透析后分装冻存。采用SDS-PAGE凝胶电泳检查抗体纯度。 

采用棋盘法确定抗原最佳包被浓度和单抗稀释倍数，测定纯化抗体的效价；采用间接竞争ELISA法测定单抗的灵敏度、竞争抑制率、交叉反应率和亲和力。 

本发明以DT13偶联OVA作为包被抗原，DT13偶联BSA作为免疫抗原，间接ELISA法检测抗体的效价，间接竞争ELISA方法作为检测样品中DT13含量的方法。此ELISA分析方法检测的线性范围为2～500ng/mL。与其它结构类似的甾体皂苷元有一定程度的交叉反应。DT13加样回收实验表明重复性好、准确度高、达到生物分析的要求。且此测定含量方法与HPLC-ELSD具有良好的相关性。 

本发明提供一种DT13完全抗原的合成方法。 

本发明提供一种单克隆抗体，其特征在于能特异性结合DT13。。 

本发明提供了基于此DT13单克隆抗体的ELISA检测方法的用途，它被应用于含有DT13的样品如中药山麦冬、大鼠血浆等样品中DT13含量的测定。该检测方法的灵敏度高，所需样品量少，过程简化，检测时间短，尤其适合大批量样品的同时检测。可为质检部门，加工生产企业提供大批量检测药材中DT13含量的方法。 

在本发明的基础上，可制备成皂苷ELISA检测试剂盒，用于大批量样本的快速、简便的检测。 

附图说明