[发明专利]一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法

权利要求书

1.一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法，其特征在于：对某种滩涂贝类投喂一定数量的混合微藻，摄食一段时间后对摄食前后滩涂贝类体内的各微藻进行定量PCR分析，根据各微藻在贝类体内的比例确定该滩涂贝类对不同微藻选择性摄食的差异。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：滩涂贝类其品种为包括泥蚶、毛蚶、青蛤、缢蛏、彩虹明樱蛤或者文蛤的所有滩涂贝类品种。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：混合微藻其微藻品种采用目前滩涂贝类苗种培育过程中常用的金藻、角毛藻、扁藻、微绿球藻、骨条藻、小硅藻、三角褐脂藻，或者是从天然水域分离出的任何单细胞藻。

4.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：混合微藻在投喂前，于20±2℃，光照强度为18~27μmol·m^-2·s^-1的条件下，在锥形瓶中采用“NML3号”培养液，其配方为100±10mg·L^-1KNO₃，10±1mg·L^-1KH₂PO₄，20±2mg·L^-1Na₂SiO₃，0.25±0.025mg·L^-1MnSO₄·H₂O，2.50±0.25mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，10±1mg·L^-1EDTA-Na₂，6±0.6μg·L^-1VB₁，0.05±0.005μg·L^-1VB₁₂，进行人工扩大培养，每天摇瓶1-2次，静置培养一周时间，通过显微观察和颗粒计数板计数，待微藻细胞浓度达到80～120cell·μl^-1，青岛大扁藻细胞密度控制在15~20cell·μL^-1时，微藻处于指数生长期，此时方可投喂稚贝。

5.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：滩涂贝类投喂混合微藻前，需要在经过沙滤基本不含任何微藻的洁净天然海水中不投饵饥饿8-10h以尽量排空肠胃内残饵，后取1±0.1g湿重的贝类样品并于-20℃以下冷冻保存以进行定量PCR分析。

6.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：投喂时取一定数量某种滩涂贝类稚贝于一定体积的塑料容器内，投喂一定量的混合微藻，投喂后取20±2mL的培养海水用0.45±0.045μm醋酸纤维滤膜过滤收集混合微藻样品并于-20℃以下冷冻保存以进行后期混合微藻的定量PCR分析；摄食0.5-1h后取1±0.1g湿重的贝类样品并于-20℃以下冷冻保存以进行定量PCR分析。

7.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：需要分别对投喂饵料的所述微藻18S rDNA进行克隆、测序及序列分析，并获得能够通过PCR扩增技术来区分此5种微藻的特异性引物（探针），它们为ChaF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR、PavF/PavR及NanF/NanR。

8.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：定量PCR分析须根据各饵料微藻的特异性引物分别对其基因组DNA进行PCR扩增并获得目标片段，以10倍拷贝数为浓度梯度的目标片段构建标准品系列，通过优化定量PCR反应体系和反应条件，建立正比于目标片段的拷贝数的荧光信号相对C_T值的定量工作曲线作为标准曲线，后通过检测混合微藻中及摄食前后稚贝体内各微藻的C_T值，依据各自的工作曲线分别计算出各样品中各微藻的含量，以目标片段拷贝数表示，从而确定各微藻在样品的比例，最终根据比较水体中初始混合微藻的比例和贝类体内摄食前后各微藻在混合微藻中的比例，确定出该滩涂贝类稚贝的对混合微藻中各微藻的摄食选择性差异。

9.根据权利要求1或2或3所述的分析方法，其特征在于：定量PCR分析每次样品的检测结果均须配以标准品及阴性对照加以校正，消除本底信号的干扰。