[发明专利]一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体为检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡。 

背景技术

视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein,RBP）是一类在人体内负责从肝脏转运视黄醇至各组织细胞的运载蛋白，对视黄醇生理功能的发挥起着重要作用。RBP主要在肝脏中合成。肝脏中分泌的RBP-视黄醇聚合物与转铁蛋白（Transthyretin，TTR）形成稳定的蛋白复合物在血液系统中循环。RBP-视黄醇-TTR复合体在视黄醇释放后解体，RBP以游离形式存在于血液系统中，由肾小球滤过，再由近端小管上皮细胞重吸收、降解。因此正常人尿液中几乎不含有RBP（含量低于300ng/ml）。若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。因此，在肾小管损伤病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到10000ng/ml以上。故尿液中RBP增高具有早期诊断意义，被认为是肾小管损伤的一个良好的早期标志物，对RBP的检测已经被广泛应用于临床上对肾脏损伤的诊断中。 

目前，医院常用的检测RBP的方法是基于免疫比浊法或酶联免疫吸附法（ELISA）。但上述方法步骤比较繁琐，测量时间较长，结果易受操作者技术水平等的影响，不确定性因素较多。而且要求操作者具有一定的操作技能，同时配备酶标仪，因此检测成本相对较高。为了达到简便、快速、高效和经济的检测尿RBP的要求，我们提出开发视黄醇结合蛋白4检测试剂盒（胶体金免疫层析法），意在建立一种肾小管损伤诊断的新技术。另外，通过专利检索，发现目前没有通过使用胶体金免疫层析法检测RBP4来诊断肾小管损伤的相关试剂盒专利。 

发明内容

本发明旨在提供一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物。 

本发明还提供了人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡及试剂盒。 

一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其制备方法包括以下步骤： 

将人视黄醇蛋白4（RBP4）单克隆抗体1标记于胶体金颗粒表面：将含有胶体金颗粒的溶液pH调节至8.2～8.7，加入人视黄醇蛋白4单克隆抗体1，震荡反应5～15分钟，用BSA封闭后离心，沉淀用硼酸缓冲液重悬后再次离心纯化；弃去上清取下层液体，即得到人视黄醇蛋白4的抗体复合物。 

胶体金颗粒的粒径为10～30nm，优选20nm。 

人视黄醇蛋白4（RBP4）单克隆抗体1与胶体金颗粒用量比为1～8μg：1mg，优选为5μg：1mg；胶体金颗粒溶液浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。 

所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物可用于制备检测视黄醇结合蛋白4的试剂及试剂盒。 

所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物进一步用来制备视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡： 

其结构包括结合垫、样品垫、分析膜和吸水纸，分析膜上包括检测线（T线）和质控线（C线）。 

结合垫的制备方法为：用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液混合（用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液的混合体积比为1:15～30，优选为1:20）后喷在结合垫材料上，结合垫的材料选自玻璃纤维素膜；胶体金稀释液为0.03～0.08mol/L、pH=7.8～8.2的Tris-HCl缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮PVP，0.2%～0.5%聚乙烯醇PEG，1.0%～3.0%蔗糖，0.1%～0.3%吐温-20；聚乙烯醇的分子量为10000～25000。 

样品垫的制备方法为：样品垫材料用处理液浸泡并干燥，样品垫材料选自玻璃纤维素膜；处理液为pH=7.2～7.4、0.01～0.02mol/L的磷酸缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%乙烯基吡咯烷酮，0.1%～0.3%吐温-20。 

分析膜的制备方法为：在分析膜上喷点RBP4单克隆抗体2和羊抗鼠IgG抗体，羊抗鼠IgG抗体在上形成质控线（C线），RBP4单克隆抗体2在下形成检测线（T线），烘干；分析膜的材料为硝酸纤维素膜（NC膜）。 

将上述样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸依次粘贴在底板上，切成4mm宽的检测试纸条并装在塑料外壳中，得到人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡。