[发明专利]一种提高植物发酵沼气产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌和应用工程菌提高植物发酵沼气产量的方法。具体是一种应用携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌对植物原料进行预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。

背景技术

沼气是一些有机物质在一定的温度、湿度、酸度条件下，隔绝空气，经微生物发酵而产生的一种以甲烷为主的可燃混合气体，是一种有多种用途的可再生能源。它能够代替石化燃料而应用于动力和热的产生，也能作为车用燃气，还能替代天然气作为生产一些化学制剂的原料。通过厌氧发酵生产沼气是一条CO₂零排放的生产途径。

沼气发酵必须有微生物参与。沼气发酵微生物是一个统称，包括发酵性细菌、产氢产乙酸菌、耗氢产乙酸菌、食氢产甲烷菌、食乙酸产甲烷菌五大类群。植物物质(包括农林废弃物，能源作物和水生植物等)是生产沼气的主要原料来源，由于能够通过光合作用而再生，资源十分的丰富。然而，在沼气发酵中，植物的发酵时间较长，有效成分转化为沼气的效率较低，通常小于50％。植物的粗纤维约占植物总物质的70～80％。粗纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素物质，其中纤维素所占的比例最大。纤维素和半纤维素水解后生成能被沼气发酵微生物食物链中之下游微生物所能利用的糖。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是由苯基丙烷结构单元通过醚键、碳-碳键联结而成的高分子化合物。用物理、化学或生物的方法于发酵之前对植物材料进行预处理使木质素水解，但是其作用很难达到完全。植物发酵沼气的预处理是其生产过程的瓶颈问题之一，是研究的热点之一。当前，对植物原料的预处理的物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学处理法具有工艺简单、效率高等特点，但所需无机酸、碱浓度高，处理后的纤维素和半纤维素损失大(回收率仅约50％)。与化学法预处理和物理法预处理相比，生物法具有反应温和、能耗较小，设备简单，不会带来环境污染等诸多优点。复合菌种方法和白腐真菌方法是生物法预处理植物原料的主要研究方向。前者一般包括多株具有分解木质素的微生物及由霉菌、细菌和放线菌等多种微生物组成的辅助功能菌的联合应用。其优势在于能够在分泌木质素酶上互补，使形成完整的木质素酶系，并且在生长上相互依存。但是，由于这些微生物的种类不同，其生长条件(包括温度的需求、酸碱度的需求和营养的需求)不可能一致，难于实现高效的表达酶。后者是应用含木质素酶的白腐真菌进行预处理。这种方法的优势在于，白腐真菌有完整的木质素酶系，但是白腐真菌生长缓慢，需较长的预处理过程。木质素酶系由木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶组成。木质素酶系具有分解木质素的功能。纤维素酶系由葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素在纤维素酶系的协同作用下水解成葡萄糖。近些年来，人们十分关注酶对于沼气发酵的作用。即在沼气生产的过程中(包括预处理和发酵过程)加入相关的酶。加酶的方法能够较好地提高沼气的产量，但是价格昂贵。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)营养要求低，繁殖迅速，是对环境无害的微生物，能分泌表达蛋白，并且兼性厌氧，对温度和酸碱环境的耐受范围较广。

发明内容

本发明的目的是为了解决当前的植物原料发酵沼气的木质素和纤维素不能有效地被水解的问题，根据木质素酶系具有水解木质素的作用，纤维素酶系具有水解纤维素为葡萄糖的作用，通过分子生物学技术，构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架，猛过氧化物酶基因表达框、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架，葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌，而提供一种应用枯草芽孢杆菌工程菌进行植物原料沼气发酵的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种提高植物发酵沼气产量的方法，其步骤是：