[发明专利]绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae, Mo）为山羊传染性胸膜肺炎（Contagious Caprine Plneuropneumonia, CCPP）主要病原之一，可感染绵羊及山羊，山羊感染Mo后临床表现为呼吸障碍、消瘦、高热、卧地不起等症状，病死率较高，给山羊养殖业造成严重的经济损失。

目前，国内外对于Mo的检测主要依靠病原分离鉴定、血清学试验以及聚合酶链式反应技术。对比三种诊断方法，传统的分离鉴定由于支原体生长条件要求较高、生长速度缓慢的特点，因此诊断成本高且难度大、耗时长，无法立即解决快速诊断问题；血清学试验主要为间接血凝试验、补体结合试验与竞争ELISA，三者敏感性差或特异性差，且不能作为病原诊断方法；聚合酶链式反应技术具有快速、准确、灵敏、特异等优点，但是其试剂成本高、操作复杂、检测设备要求高，不适宜基层兽医单位使用。因此，本发明设计了针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因环介导等温扩增试验特异性内外引物，通过优化反应条件及体系，建立一种快速、灵敏、特异、简易的Mo检测方法并制备检测试剂盒，为山羊源Mo防控提供了一定的技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法，能够避免临床对于绵羊肺炎支原体感染山羊疑似病例的病原检测盲目性与繁琐性，并降低以聚合酶链式反应技术进行绵羊肺炎支原体检测的高成本、高设备要求，为山羊源绵羊肺炎支原体防治提供技术支持，以克服现有技术存在的诊断成本高且难度大、耗时长等诸多不足。

本发明的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒原料配方为：1000~2000μL反应液，100~200μL Bst DNA聚合酶，50~100μL阳性对照，50~100μL阴性对照，1mL-2 mL液体石蜡，1mL-2 mL超纯水。

所述反应液包括内引物混合液、外引物混合液、LAMP反应缓冲液、Mg²⁺及dNTP，五种液体于反应液中体积比为2:2:2.5:2:1。

所述内引物与外引物为针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的环介导等温扩增试验特异性内引物FIP与BIP、外引物F3与B3，内引物浓度为20μmol/ L，外引物浓度为5μmol/ L，引物序列见表1：

表1 内外引物序列

引物序列（5’—3’）FIPACTTCATCCTGCACTCTGTGTCTTTT CAGCAGTAAGGAATATTCCACABIPTTAGGGATGTAAACTGCTGTTGTTTT CCGTCAAGACTAAATCATTTCCF3ATTGAGATACGGCCCAGAB3GCCGTCACTTTCTAATAAGGT

所述LAMP反应缓冲液为10×ThermoPol Reaction Buffer，它包括200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L（NH₄）₂SO₄、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO₄和1%Triton X-100。