[发明专利]罗氏沼虾性别特异分子标记、及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，本发明涉及罗氏沼虾雌性基因组特异序列，具体的说，是罗氏沼虾性别特异分子标记、及其筛选方法和应用。

背景技术

罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii），素有淡水虾王之称，原产地集中在厄瓜多尔沿岸，是目前世界上养殖量最高的三大虾种之一，其壳薄体肥，肉质鲜嫩，味道鲜美，营养丰富。1976年自日本引进中国以来，已在南方IO多个省（市、区）推广养殖，经济效益可观，在我国的淡水养殖中占有重要地位。

罗氏沼虾雌雄异体，雄性的生长速率相比于雌性高出10-20％，意味着在生活史的同一阶段，雄性能达到更大的规格。由于雌雄两型性的存在，对其性别进行控制，培育单性群体，可以有效提高单位面积的养殖产量。因此，对罗氏沼虾性别决定机制的探索一直都是国际上研究的热点和难点。虽然科学家们对于寻找甲壳动物性染色体做出了大量的努力，但由于虾蟹类在进化上的原始性，有丝分裂中期染色体在形态上多呈点状，且数目众多，导致核型分析困难，故在包括罗氏沼虾在内已报道的虾蟹类染色体研究中，均未发现性染色体的存在，性别决定机制仍然是一个谜。

获得虾蟹类稳定的性别标记不仅可以帮助我们确定性染色体的有无、揭开性别决定机制的谜团，更可以进一步建立单性养殖的系统，提高养殖产量。近年来，分子标记技术越来越广泛地被应用于虾蟹类性别相关的研究中。利用AFLP（amplified fragment length polymorphism）技术已经获得了日本对虾、斑节对虾和中国明对虾的连锁图谱，但性别连锁的标记尚未有报道。（Stephen S Moore，Vicki Whan，Gerard P Davis，Keren Byrne，David J.S Hetzel，Nigel Preston.The development and application of genetic markers for the Kuruma prawn Penaeus japonicus.Aquaculture.1999，173：19-32；Kate Wilson，YutaoLi，Vicki Whan Sigrid Lehnert，Keren Byrne，Stephen Moore，Siriporn Pongsomboon，Anchalee Tassanakajon，George Rosenberg，Elizabeth Ballment，Zahra Fayazi，Jennifer Swan，Matthew Kenway，John Benzie.Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphism.Aquaculture.2002，204：297-309；王伟继，孔杰，董世瑞，等.中国明对虾AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建.动物学报，2006，52：575-584）。Li也构建了一个日本对虾的连锁图谱，其中在母系连锁图谱中有一个推测的性别标记，但Li也提出基于连锁不平衡（或称为基因关联），此推测的标记不一定与性别差异基因相连锁。（Li，Y.，Byrne,K Miggiano,E.，Whan,V.，Moore,S.，Sandy Keys，Crocos P.，Preston N.and Lehnert，S.Genetic mapping of thekuruma prawn Penaeus japonicus using AFLP markers.Aquaculture.2003，219，143-156）。Perez构建了一个南美白对虾性别特异的连锁图谱。（Franklin Pérez,Constanza Erazo，Mariuxi Zhinaula，Filip Volckaert，Jorge Calderón.A sex-specific linkage map of the white shrimp Penaeus（Litopenaeus）vannameibased on AFLP markers.Aquaculture.2004，242：105-118）。同样地，Zhang也构建了南美白对虾的连锁图谱，在雌性连锁图谱中有一个性别相关的微卫星标记。（Liusuo Zhang，Changjian Yang，Yang Zhang，Li Li，Xiaoming Zhang，Qingli Zhang and Jianhai Xiang.A genetic linkage map of Pacific white shrimp（Litopenaeus vannamei）：sex-linked microsatellite markers and high recombination rates.Genetica，2007 Volume 131，1，37-49，）但是这些通过遗传连锁图谱发现的性别连锁标记没有在其他的个体中进行验证，且很难分辨种群中没有亲缘关系的两性个体。此外，Zhang等使用25对AFLP引物和16对SAMPL引物获得了2110条条带，但在南美白对虾(Penaeus chiniensis)中并没有筛选获得性别特异的标记（Liusuo Zhang，Xiaoyu Kong，Ziniu Yu，Jie Kong，Limei Chen.A survey of genetic changes and search for sex-specific markers by AFLP and SAMPL in a breeding program of Chinese shrimp.Journal of ShellfisheriesResearch，2004，Vol.23，No.3，897-901）。Khamnantong等尽管采用256对引物组合筛选了斑节对虾6-10个DNA池，获得了6个性相关的候选片段，但是PCR结果表明在雌雄基因组中都有阳性扩增，且这些片段与性染色体并不连锁（Bavornlak Khamnamtong，Supaporn Thumrungtanakit，Sirawut Klinbunga,Takashi Aoki，Ikuo Hirono，Piamsak Menasvet，Identification of Sex-specific Expression Markers in the Giant Tiger Shrimp(Penaeus monodon).Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2006,39：1,37-45）。另外，对蟹类性别标记的研究也尚未取得十分可靠的结果。邱涛用对中华绒螯蟹雌雄群体和个体进行RAPD分析，虽然获得了雄性特异的候选标记，但是并未进一步验证（邱涛，陆仁后，项超美，张菁，谢浩.用RAPD技术识别中华绒螯蟹雌雄差异.水产学报，1998,2,175-177）。王艺磊利用AFLP技术筛选出锯缘青蟹的雌雄差异片段，证明了雌雄基因组间存在着DNA序列上的差异，但是没有将这些差异片段形成真正的分子标记（王艺磊，戴军，姚扬烈，张子平.利用AFLP技术筛选锯缘青蟹雌雄差异DNA片段.中国水产科学.2004年,4,286-290）。