[发明专利]大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法

说明书

技术领域

    本发明属于医药技术领域，尤其是一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。

背景技术

草乌甲素是一种强效镇痛剂和抗炎剂，用于治疗慢性疼痛，类风湿性关节炎、骨关节炎等。中国国家食品与药品监督管理局（SFDA）已于19世纪80年代，批准BLA肌肉注射剂(0.2 mg/2 mL)、片剂(0.4 mg)和软胶囊(0.4 mg)用于临床使用。但二酯-二萜型乌头属生物碱如BLA的潜在毒性可引起心律失常和强心作用，动物研究中，当使用大剂量BLA时，毒性作用如呼吸抑制、脑积水和室性心律失常见于报道。鉴于草乌甲素良好的临床疗效以及潜在的心脏毒性等副作用，了解该药物的药代动力学特征，绘制出具有吸收相、峰浓度、分布相和消除相的完整血药浓度曲线，并对该曲线进行非房室模型和房室模型处理，经处理提取的药动学参数用于解释药物的体内命运、指导新药开发以及指导临床合理用药是十分必要的一项工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。

本发明的大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法，该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的，其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理；乙醚作为萃取溶剂；液相条件中流动相由0.1%甲酸水和-0.1%甲酸甲醇55:45，V/V组成；新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。

血浆样品的处理是LC-MS/MS法测定获得高灵敏度的关键过程。常见的血浆样品处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。曾尝试采用蛋白沉淀法和固相萃取法，但前者蛋白沉淀不完全，药物定量限过高，后者操作繁琐、回收率与灵敏度均非常低。因此，本发明最终采用相对简便、灵敏和回收率更高的液-液萃取法作为草乌甲素血浆样品的处理方法。

在萃取溶剂的选择上，曾采用乙醚-环己烷（4:1）混合溶液、乙醚-正己烷（4:1）混合溶液、乙醚-二氯甲烷（4:1）混合溶液以及正己烷作萃取溶剂进行提取，结果表明混合溶剂的提取效率均不如单纯采用乙醚，正己烷的提取效果虽与乙醚相当，但提出的杂质较多。因此，确定乙醚作为萃取溶剂，提取后的样品纯净、回收率高，几乎无杂质干扰。实验中还考察了碱化试剂（pH 9.0的磷酸盐缓冲液）对提取效率的影响，结果表明碱化处理对药物的提取效率无明显作用，故提取过程未作碱化处理。

液相条件中流动相由0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇（55:45，V/V）组成，加入甲酸可以促进被分析物的离子化，提高检测的灵敏度。采用C18 50mm短柱进行分析，单个样品的分析时间仅为3.5min，大大增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量样品的的快速，本方法亦可用于临床快速监测患者的血药浓度。

内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要，理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。文献报道草乌甲素血浆样品的测定曾采用酮康唑5、左吡坦6或多潘立酮[i]作为内标，但它们与草乌甲素的结构差别较大，在预实验中发现上述内标无法达到本项目对草乌甲素口服血药浓度测定高灵敏度的要求。为此，我们选择与草乌甲素同属“乌头碱类生物碱”结构的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱作为内标进行尝试，发现乌头碱的定量离子对与草乌甲素过于接近，次乌头碱的出峰时间与草乌甲素过于接近，因此选择出峰时间短，响应值高，峰形良好的新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。

本发明所建立的草乌甲素血浆样品LC-MS-MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2010年版以及SFDA 2005年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。特别指出的是，本测定方法最低定量限达到0.02ng/ml，远远超出文献报道的最低定量限0.12ng/ml，可用于动物以及人体口服草乌甲素的药代动力学研究。

附图说明

图1为大鼠肌注不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。

图2为大鼠口服不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。

图3为草乌甲素静脉注射三室模型示意图。其中，中央室1，还存在快分布相2，分布相3。

图4为大鼠静脉注射草乌甲素(0.02mg/kg)的血药浓度-时间曲线。

图5为大鼠口服不同剂量草乌甲素混悬液后平均血药浓度-时间曲线。

图6为大鼠口服药代动力学试验。

具体实施方式

实施例1：草乌甲素大鼠口服药代动力学试验。