[发明专利]斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及斑点叉尾鮰疾病预防用疫苗，具体涉及肠套叠灭活疫苗的制备方法与免疫方法。

背景技术

斑点叉尾鮰(Ictaclurus punctatus)隶属鲶形目，鮰科鱼类，又称沟鲶、河鲶。其原产地为美国密西西比河，是一种大型淡水性鱼类，最大个体可达35kg以上。该鱼具有食性杂、抗病力强、适应性广、生长快、肉质细嫩、营养丰富、经济价值高等特点。斑点叉尾鮰含肉率为56.14％，其中粗脂肪占2.99％，粗蛋白占16.31%，其肌肉干物质中氨基酸含量为79.17%，其中鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨基酸、甘氨酸、丙氨酸)占总氨基酸的6.36%，具有滋补和催乳功能，深受消费者欢迎。斑点叉尾鮰于八十年代引入我国，在湖北、湖南、四川、重庆、贵州等30多个省市形成了较大规模的养殖。

近年来，随着网箱养殖的规模扩大和养殖密度加大，一些地区养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，暴发性死亡时有发生，给养殖户造成了重大的经济损失。斑点叉尾鮰肠套叠是近年来发现的发病频率较高的急性传染性疾病。这种传染性疾病具有发病突然，来势凶猛，传染快，呈流行性等特点。目前这种疾病在我国相当严重。多年来，这种疾病的防治主要依赖抗菌药物，但随着社会的发展，这将受到越来越严厉的限制，因此疫苗的开发与使用已成为必然趋势。实际上，在过去的10-20年间，接种疫苗预防养殖鱼类传染性疾病已经取得巨大成功。如A.salmonicida、Virbrio sp.、Yersinia sp.等多种疫苗已商业化。而且不久的将来，巴斯德菌病(Pasteurellosis)和链球菌病(Streptococcosis)也有望通过免疫预防得到控制。A.hydrophila感染的免疫预防虽也取得不同程度的成功，在基因工程改良的弱毒疫苗、亚单位疫苗等方面有所突破，但试验中的疫苗，以单价苗居多，多联疫苗少见。鉴于斑点叉尾鮰肠套叠可能因多种细菌感染所致，所以研制斑点叉尾鮰肠套叠二联或多联灭活疫苗非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供预防斑点叉尾鮰肠套叠的暴发和传播的疫苗，提供一种斑点叉尾鮰肠套叠的二联灭活疫苗的制备方法。利用从病鱼体内分离的毒力强的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌制成的灭活疫苗，对斑点叉尾肠套叠起到有效的保护作用，能有效缓解斑点叉尾鮰的抗药性和提高斑点叉尾鮰的产量。

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。

该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落园形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。

嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，如：溶血素、组织毒素、坏死毒素、肠毒素和蛋白酶等。

在具有典型出血性肠套叠症状的斑点叉尾鮰肠道中可以分离得到致病性强的嗜麦芽寡养单胞菌和嗜水气单胞菌，用于制备灭活疫苗。该菌的分离、鉴定等方法前人已有研究。

斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的免疫方法，主要是采用下述方法： 

A、疫苗的抗原为嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌，将灭活完全的菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗；

B、用二联疫苗对斑点叉尾鮰鱼体浸泡接种或注射接种免疫。

其菌种包括从发病斑点叉尾鮰体内分离出来的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法，按以下步骤进行：

（1）将嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到无菌TSA上，30±0.5℃培养24小时；

（2）分别将步骤（1）培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0.5℃，摇床速度280～300r/min，培养时间为24小时；

（3）将步骤（2）中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用无菌的0.85%的生理盐水稀释菌体到10⁸或10⁹CFU/ml；

（4）取出步骤（3）中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为0.3%（V/V），32±0.5℃下灭活72小时；

（5）根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4℃冰箱内储藏。