[发明专利]一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法，具体涉及转基因玉米BT176检测用质粒标准分子及其制备方法。   背景技术

随着转基因市场的不断扩大，转基因生物和产品的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内的争论和关注，那么转基因产品的检测技术尤其重要，世界各国也纷纷出台了很多的政策法规，2002年，我国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，要求对转基因成分进行检测，并要求检测结果为阳性者需要标识。而世界上的其他国家，例如欧盟、日本、澳洲、韩国也纷纷出台相关政策，要求对超过一定含量的转基因植物产品进行标识。

基于核酸的PCR检测技术是目前应用最广泛的转基因植物检测技术。根据不同的外源DNA片段，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测、品系特异性PCR检测。构建特异性是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区的DNA序列实现的。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因检测中使用较多。

为了使得检测结果的准确性得到保障，在检测过程中需要使用标准物质。目前大量使用的标准参考物质是由未加工的原材料制备而成的——基体标准物质，然而，由于基质效应和加工过程中完整DNA分子的缺失等原因使得其作为定量标准品应用时具有很大局限性。同时，其制备复杂，价格昂贵，且不利于长期储存。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高。

转基因玉米品系BT176，商品名称为NaturGard KnockOut玉米，是经过特异性基因修饰而具有抗欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis）抗性的玉米品系。欧洲玉米螟是一种对玉米危害严重的农业害虫，能杀死鳞翅目昆虫，对家畜和人类不敏感。BT176玉米品系可以生产一种剪切杀虫蛋白，来自苏云金芽孢杆菌亚种kurstaki菌株HD-1的Cry1Ab；也能表达土壤吸水链霉菌的bar基因，编码草铵膦乙酰转移酶(PAT）酶。目前，ISO21570、欧盟参考物质及测量研究所对于转基因玉米BT176的检测均为构建特异性检测，因此，开发一种转基因玉米BT176构建特异性检测用质粒标准分子具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米BT176检测用质粒标准分子及其制备方法，本发明质粒标准分子可用作转基因玉米BT176构建特异性检测时的阳性标准品。

为实现上述目的，本发明提供一种转基因玉米BT176检测用质粒标准分子，该质粒标准分子是将玉米内标准基因zSSIIb特异性序列、转基因玉米BT176的构建特异性序列依次构建到质粒载体中而得；所述玉米内标准基因zSSIIb特异性序列如SEQ ID No.1所示，所述转基因玉米BT176的构建特异性序列如SEQ ID No.2所示。

本发明质粒标准分子中，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

本发明的另一个目的在于提供一种上述转基因玉米BT176检测用质粒标准分子的制备方法，该制备方法为：将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列经重叠PCR法连接起来，并将连接产物构建到质粒载体上，以获得上述质粒标准分子。

上述制备方法中，所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

上述制备方法中，所述SEQ ID No.2所示核苷酸序列由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

上述制备方法中，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

上述质粒标准分子的制备方法，具体步骤如下：

（1）由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品，得SEQ ID No.1所示核苷酸序列的扩增产物；