[发明专利]一种抗马兜铃内酰胺FI和马兜铃酸IVa单克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域和中药检测领域，具体涉及一种抗马兜铃内酰胺FI(AL-FI)和马兜铃酸IVa(AA-IVa)单克隆抗体的制备方法及基于该单抗的竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)检测方法，可用于药材和生物样品中肾毒性化合物AL-FI和/或AA-IVa的高灵敏度、高通量检测。

背景技术

服用马兜铃酸(AA)类化合物或含有该类化合物的中草药会导致马兜铃酸肾病(AAN)，在国内外引起了高度关注。马兜铃酸被证明具有肾毒性、致畸性、致癌性^[1，2]，而我们前期的研究发现，马兜铃科药用植物的另一类主要成分：马兜铃内酰胺(AL)也具有明显的肾细胞肾毒性^[3-6]。AL类化合物在植物界中的分布范围远比AA类化合物广泛，在马兜铃科以外的番荔枝科、胡椒科、三白草科、防己科和樟科的20个属60余种植物中均有报道^[4，7]。2010版药典收载的常用中药中报道含有AL类化合物的中药包括：马兜铃、天仙藤、鱼腥草、三白草、海风藤、荜茇、胡椒、粉防己、亚乎奴等^[4，7]。我们前期的研究显示AL-FI(结构如图1所示)具有肾细胞毒性(IC₅₀＝94.33μM，MTT)，目前报道含有AL-FI的植物包括瓜叶马兜铃、异叶马兜铃、大叶马兜铃、线果马兜铃、鱼腥草、三白草、海风藤、荜茇、胡椒、卵叶胡椒、粉防己、亚乎奴、石南藤和瓜馥木、白叶瓜馥木、多脉瓜馥木以及Oxymitra velutina、Pararistolochia flos-avis、Piper argyrophyllum、P.boehimerifolium、P.hamiltonii、P.longum、P.wightii^[4，7]。

马兜铃科植物中AL类化合物的定量分析方法涉及高效液相色谱(HPLC)与二极管阵列检测器(DAD)^[8-10]、荧光检测器(FLD)^[11]以及质谱检测器(MS)^[12]联用等技术。我们前期的研究显示，AL类化合物虽然在多种植物中有分布，但是含量普遍较低，因此利用这些植物的总提物进行HPLC分析往往不容易在非马兜铃科植物中检测到该类化合物，必须先用氯仿(此为有毒试剂，须避免使用)进行萃取和富集，才能进行HPLC-DAD定性分析，而进行定量分析则更困难。这种情况对相关中药的质量控制及安全性标准的提高极为不利。目前已发表的对非马兜铃科植物中的AL类化合物进行定量分析的技术仅有HPLC-DAD^[13-15]，测定了鱼腥草和三白草中AL-FI的含量。胡椒科的药用植物如海风藤、荜茇和胡椒中AL类化合物的含量测定尚无报道。AL的HPLC检测方法存在的问题是仪器昂贵，对操作人员及仪器维护的要求高，样品前处理复杂，需要消耗有毒的有机试剂，不环保，也不利于进行现场检测和高通量检测。

基于单克隆抗体的酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有仪器简单、环保、样品前处理简单等优点，可以快速(高通量)检测目标成分尤其是微量成分的含量。鉴于AL-FI类化合物具有肾细胞毒性且在常用中药中的分布范围广泛，建立基于AL单抗的免疫分析方法并应用于该类化合物的定性/定量分析，有利于完善相关药材的质量控制技术，保障用药安全。但至今尚未有针对AL类化合物单克隆抗体的报道。因此，发明AL类化合物单克隆抗体的制备方法及基于该类抗体的分析检测方法具有十分重要的意义。AL类化合物为不具免疫原性的小分子化合物，自身缺乏可与载体蛋白直接偶联的活性官能团。因而必须对AL的化合物结构进行改造，引入带活性基团的连接臂，再将其与载体蛋白进行偶联才能获得可供免疫用的人工抗原。这类化合物为平面结构，水溶性差，在人工抗原的制备方面存在一定的技术难度。本发明首次尝试制备抗AL类化合物的单克隆抗体。