[发明专利]一种优化的谷氨酰胺转胺酶启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酰胺转胺酶启动子及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。

尽管微生物MTG已实现了工业化生产，但依靠菌种筛选和过程优化的传统发酵技术获得的产量仍然较为有限，远不能满足市场对MTG日益增长的需求。随着蛋白质表达技术的迅速发展，通过分子生物学的方法构建MTG高产重组菌成为国内外研究者关注的一个热点。为进一步提高产量，日本味之素公司率先开展了MTG重组菌构建的工作。随后，德国Martin-Luther University、台湾食品工业发展研究所、台湾国立中兴大学、中科院微生物研究所、华南理工大学及诺和诺德(中国)制药有限公司等相关研究机构或企业相继报导了重组MTG的制备策略。至此，链霉菌MTG已在大肠杆菌、酵母、链霉菌及谷氨酸棒杆菌等宿主中成功表达。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外需经活化蛋白酶活化成有活性MTG。大肠杆菌，酵母等表达宿主，不能够合成活化蛋白酶，MTG表达后需外加活化蛋白酶。而链霉菌宿主自身就可以分泌改类活化蛋白酶，可以直接获得有活性的MTG，因此链霉菌可以作为MTG表达的理想宿主。

在表达系统中，启动子强度对蛋白的表达量影响很大。在链霉菌表达系统中，与其他表达系统相比，启动子比较少，而且通用性低，不适合MTG的表达。因此有必要开发新的启动子。很多文献表明，MTG自身启动子可以用于MTG的异源表达，因此MTG自身启动子可以作为一个高效表达启动子用于蛋白表达。

发明内容

为解决上述问题，我们对MTG自身启动子进行了研究，通过逐段缺失，确定了启动子的核心区域和调控序列。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genebank：EU477523）。利用PCR技术，设计引物，上游引物TGU-F：

TTCGAGCTCGGTACCCACCCCGCTGAATGGGACTCTTCGT(Kpn I)，下游引物TGU-R:CGCGGATCCGGAATTCCATATGCGTCGCCGGTCATGACCTGGTG，获得上游序列(tgU)，通过对基因tgU上下游的逐段缺失，确定了MTG启动子核心序列及调控序列，并将优化后的启动子序列用于MTG的表达，产量得到显著提高，因此，MTG启动子可以被链霉菌工程菌识别并启动，具有广泛的应用价值。

本发明所用到的培养基：

YEME培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖340g/L、MgCl₂·6H₂O 5mmoL/L、甘氨酸5g/L；

MS培养基：甘露醇20g/L、黄豆粉20g/L、琼脂粉20g/L，pH7.2-7.3；

R5培养基：蔗糖103g/L、K₂SO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 10.12g/L、葡萄糖10g/L、Difco酪蛋白氨基酸0.1g/L、Oxoid酵母提取物5g/L、TES 5.73g/L。称取5.5g Difco琼脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115°C灭菌15min。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH₂PO₄(0.5%)2.5mL、CaCl₂·2H₂O(5mol/l)1mL、

L-脯氨酸(20%)3.75mL、NaOH(1mol/L)2.5mL；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖4g/L、麦芽粉(Difco)3g/L、酵母粉4g/L、琼脂粉20g/L，pH 7.0；