[发明专利]通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，在65℃下的半衰期仅有15 min左右，热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且易于失活，增加了生产成本。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面（Johannes TW et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267）。 

发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis ）CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311）。本发明以华根霉脂肪酶基因为模板，利用定向进化技术获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

酶分子的热稳定性提高可以用其半衰期（t₅₀）来体现。即酶的活力降低到原来活力一半时所需要的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，则稳定性差。因此，t₅₀的提高代表了酶分子热稳定性的提高。

    定义：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

脂肪酶突变体的标识

采用 “原始氨基酸 位置 替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如 Glu107Gly， 表示位置107的氨基酸由亲本脂肪酶的Glu替换成Gly，位置的编号对应于附件序列表1 中亲本华根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列编号。

如 Leu180His/ Thr218Ser，表示位置180和位置218的氨基酸都发生了突变。

发明内容

本发明的目的在于提供通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体。

本发明的技术方案：通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体，由亲本华根霉（Rhizopus chinensis ）CCTCC M 201021脂肪酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得脂肪酶突变体，亲本华根霉氨基酸序列SEQ ID NO: 1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为：，

表1

华根霉脂肪酶氨基酸突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，有22个突变氨基酸，底色标记显示。

用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为：pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα，pPICZ；

用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。

与亲本华根霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以在65℃下的半衰期t₅₀来表示热稳定性的提高，所述脂肪酶突变体的半衰期以及提高的倍数如下： 

表2

亲本华根霉脂肪酶在65℃下的半衰期t₅₀为16.5 min。