[发明专利]一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA提取方法。具体涉及一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法。

背景技术

在分子生物学技术的研究中，关键在于DNA的提取。常规的分子生物学操作如PCR、酶切、杂交对DNA的质量要求不高，一般分子生物学实验指导书上的常规方法如浓盐法、酚氯仿抽提法等即可满足其要求。

随着全基因组随机测序方法—霹弹法（shotgun）的成熟，计算机拼装算法的发展，近年来细菌基因组测序以每年50%的速度增长。新一代高通量基因组测序仪的迅速发展（Solexa，454GS-FLX，SOLID，tSMS）给基因组领域带来革命性的突破。目前，细菌基因组研究进展迅猛，已有684个真细菌基因组和51个古细菌基因组序列发布。而且，对于细菌全基因序列的测定是分析细菌生物合成过程、基因调控、蛋白表达等之前非常必要的工作。通过全基因组测序，可以预测所含有的编码序列、可能表达的蛋白、与各种细胞功能相关的基因，还可以预测未知功能的基因等，从而可开创性的研究预测一些可能的方向，使得生物学实验具有可验证性和可循证性。但全基因组测序对DNA的样品具有高纯度、大片段的要求，不同于一般PCR样品的要求。

对于全基因组测序的基因组文库构建，DNA的需求量较大，长度至少大于23kb，而且质量要求较高，应尽量避免多糖、蛋白质的残留，否则影响库的构建及后续测序工作。因此，一次性获取高质高量的DNA就相当必要。

某些细菌在细胞壁外被一层厚度不定的透明胶状物质所包被，这层物质统称为糖被。它通常由多糖类、多肽类或多糖与多糖蛋白复合体组成。糖被具粘稠的特性，在进行DNA提取时，会与DNA结合形成共沉淀，获得的DNA溶液常常黏度大乃至呈胶状，在很大程度上影响基因组DNA提取的质量和数量。所以，如何高效简便地去除细菌的多糖类物质，对提取纯化细菌基因组DNA来说至关重要。

本实验室于2010年6月在华大基因科技股份有限公司启动了一株产多糖细菌的全基因组测序项目，但在提取该菌株全基因组DAN样品时发现，常规提取方法无法达到完全去除多糖类物质的目的，不能满足测序建库要求。而且多糖类物质对核酸限制性内切酶和PCR都有抑制作用。因此，本发明提供了一种适合于产糖被细菌的DNA提取体系，可获得高纯度基因组DNA，而且DNA含量高，片段在23kb以上，完全满足全基因组测序文库构建及一般分子生物学实验操作的要求。采用该方法提取的细菌DNA经华大基因科技股份有限公司检测，检测结论为合格，达到1类样品标准，可以用于全基因组测序文库构建。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作安全、简便、高通量、成本低的一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法，该方法包括以下步骤：

（1）向3~6mL产糖被细菌的培养物中加入400μL DNA提取缓冲液和10μL溶菌酶的水溶液，37℃下静置10min，再加入10μL蛋白酶K的水溶液，65℃下静置1h；

（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；

（3）向步骤（2）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；

（4）向步骤（3）得到的上清液中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加DNA提取缓冲液溶解；

（5）向步骤（4）得到的体系中加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；

（6）向步骤（5）得到的体系中加入PEG6000，混匀，50℃下静置10min；

（7）向步骤（6）得到的体系中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；

（8）向步骤（7）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；

（9）向步骤（8）得到的上清中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加200μl ddH₂O或者TE缓冲液溶解，即为提取到的DNA溶液，-20℃保存备用。