[发明专利]一种榉树无菌播种方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及林业科学中的林木组织培养育苗技术，具体是一种榉树无菌播种方法。

二、背景技术

榉树（Zelkova schneideriana）属于榆科（Ulmaceae family）榉属(Zelkova)，落叶大乔木，分布于地中海东部至亚洲东部，约10个物种。我国主要产于辽东半岛至西南以东的广大地区。具有树龄长，抗风、抗早、病虫害少、材质优良等特点。榉树木材致密坚硬，纹理美观，不易伸缩与挠曲，耐腐性强，是造船、桥梁以及生产各类高档家具和工艺品的上等木材，属于高档的硬阔叶用材树种；茎皮含纤维，且含量较多，是制造人造棉、绳索和造纸的原料；树根根系发达，能够固持水土，保养水源，改善土壤透气性和结构，是很好的水土保持树种；树形优美，树冠冠幅大，叶色季相变化丰富，因而又是深受人们喜爱的传统色叶园林树种和重要的园林绿化景观树种。由于榉树具有较高经济、生态和景观利用价值，且现存榉树资源非常紧缺，在第一批《国家重点保护野生植物名录》中，榉树被列为国家二级重点保护的野生植物。

榉树花小，落花落果现象严重，且种子的结实率仅在10%左右，已被列为国家二类保护植物。现阶段，我国用材榉木主要依靠进口。开展榉树组织培养研究，对加速优良榉树苗木的繁殖，制备人工种子，开展细胞融合和体细胞杂交等生物技术育种有着极其重要的意义。由于榉树种子消毒极难，消毒后又不易萌发，给榉树的组织培养带来一定困难。因此开展榉树无菌播种技术研究，对于突破榉树组织培养瓶颈具有重要意义。

三、发明内容

本发明的目的提供一种榉树无菌播种方法。利用榉树成熟合子胚进行无菌播种，通过成熟合子胚的脱分化和再分化过程培育出榉树有根组培小苗。以解决榉树种子不易消毒，消毒后不萌发等问题，突破利用榉树成熟合子胚繁育的瓶颈。

本发明通过以下技术方案达到上述目的，一种榉树无菌播种方法，包括如下步骤：

1、外植体的采集、消毒

收集榉树种子，将采回的种子用清水浸泡1天，再用洗洁精搓洗，后用去离子水清洗1～3次，置于超净工作台上去种皮。将去除种皮的成熟合子胚用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗1～3次，再用0.1％HgCl₂以振荡的方式进行灭菌处理 4～6 min，用无菌水冲洗3～5次。

2、成熟合子胚愈伤诱导、愈伤增殖、芽分化培养、单芽生根培养

将消毒好的去种皮的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.0～2.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为25±2℃，1000～1500LX，每天光照10～14 h为宜。30 d后将诱导的大团愈伤组织分割成小团，转接到改良WPM+6-BA0.5～1.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织的增殖。愈伤组织增殖到一定数量后，转入改良WPM+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0～1.0 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂4000 mg·L^-1的分化培养基上，诱导愈伤组织分化出芽。

将诱导出的株高1.0 cm以上的单芽剪下，接种到生根培养基1/2改良WPM+ IBA 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖20000 mg·L^-1+琼脂5000 mg·L^-1中诱导生根。

所述改良WPM培养基的组成为：

KNO₃                   900mg·L^-1

NH₄NO₃                 400 mg·L^-1

CaCl₂.2H₂O              264 mg·L^-1

MgSO₄.7H₂O              370 mg·L^-1