[发明专利]一种单一聚合度壳寡糖制备方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种高纯单一聚合度壳寡糖制备方法。

背景技术

壳聚糖是一个天然的线性多糖，由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。由于壳聚糖来源丰富，且安全无毒具有良好的生物兼容性，与人体细胞有良好的相容性，在食品医药，农业，材料科学领域具有很大的应用潜力。壳寡糖，又称低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖，是壳聚糖的降解产物。与壳聚糖相比，低分子量的壳寡糖水溶性大大提高，这有利于生物体吸收和利用。壳寡糖是目前仅知的唯一天然碱性寡糖，被发现具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，调节血糖血脂，增强免疫力，活化肠道菌群等。壳寡糖显示了比壳聚糖更优越的生物活性，而这些活性作用产生的机理研究，将对人类及动植物的健康发展具有积极的推动作用。

目前，壳寡糖主要通过壳聚糖的酸解，氧化降解，或酶解三种技术得到。然而，这些技术制备的壳寡糖产物是一个非常复杂的混合物，其中含有各个分子量各种脱乙酰度的壳寡糖。而大部分壳寡糖的生物活性都是采用这些混合物进行实验，这很难知道具体是哪个或哪些壳寡糖分子在生物活性试验中起作用。因此，为了进一步研究壳寡糖的生物活性，从壳寡糖混合物中分离得到带有准确脱乙酰度和窄聚合度的壳寡糖是十分必要的。然而当前的分离技术对于单一聚合度壳寡糖的分辨率是低的，尤其对于聚合度4以上的壳寡糖分离还是非常困难的，而一般认为壳寡糖的生物活性要求其聚合度至少要大于4。单一聚合度的壳寡糖的分离技术对于壳寡糖的活性筛选及进一步在食品医药中的应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种单一聚合度壳寡糖的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种单一聚合度壳寡糖的制备方法，将全脱乙酰化壳寡糖溶解过滤后用离子交换色谱柱CM Sephadex C-25以0-3M浓度的NaCl溶液在2-5mL/min-1的流速下进行分离纯化，收集240-360min、360-460min、460-560min、560-640min、640-720min、720-780min、780-840min的洗脱液，将所得洗脱液分别经活性碳萃取脱盐后浓缩，即得到单一聚合度全脱乙酰化壳寡糖。

所述单一聚合度全脱乙酰化壳寡糖为式I所示，

式I中n=2,3,4,5,6,7或8。

所述全脱乙酰化壳寡糖为将壳聚糖经酸降解，酸浓度为4-12mol/L，降解后采用醇将其沉淀，沉淀后离心，上清液浓缩后待用。

所述全脱乙酰化壳寡糖为脱乙酰度大于80％的壳聚糖中加入酸，在60-80℃下降解2-6h；降解后加入乙醇进行沉淀，沉淀后以4000g离心15min，收集上清浓缩后冷冻干燥得全脱乙酰化壳寡糖，待用；其中乙酰度大于80％的壳聚糖与酸的质量体积比为1：10-100。

所述降解后加入乙醇，使降解液中乙醇最终浓度为60-90％（体积分数）。将所述全脱乙酰化壳寡糖于pH=3-6的酸性溶液中溶解，而后并用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。

本发明的优点

1.本发明采用离子交换色谱分离得到高纯度的单一聚合度系列壳寡糖（二糖至八糖），具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少，只经过一步分离就能够得到纯的单一聚合度壳寡糖。

2.采用本发明方法得到的壳寡糖利用HPLC检测其纯度，其中全脱乙酰化壳二糖至壳六糖纯度大于98％，全脱乙酰化壳七糖纯度大于92％，全脱乙酰化壳八糖纯度大于75％。

附图说明

图1为本发明实施例提供的离子交换色谱制备单一聚合度壳寡糖的的洗脱层析图。

图2A、B、C、D、E、F、G为本发明实施例提供的分离到的单一聚合度壳寡糖的高效液相分析谱图。

图3A、B、C、D、E、F为本发明实施例提供的分离到的单一聚合度壳寡糖的质谱分析图谱。

具体实施例

实施例1

将1g高脱乙酰度（90％）的壳聚糖置于三口瓶中，加入6mol/L盐酸降解壳聚糖制备全脱乙酰化的壳寡糖溶液。加入盐酸的体积与壳聚糖质量比为50:1，在70℃下降解5h。

反应后离心去除不溶物，上清液进行浓缩，并加入乙醇进行沉淀。使上清液中乙醇最终浓度为70％（体积分数）而后以4000g离心15min，收集上清浓缩后冷冻干燥得全脱乙酰化壳寡糖样品。