[发明专利]用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂

权利要求书

1.用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

2.权利要求1所述引物在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。

3.一种用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，所述重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN-γ。其中所述三种重组蛋白分别具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中所述三种重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示。

5.权利要求3所述的用于检测牛分枝杆菌感染的基因工程制剂，其中所述三种重组蛋白的混合比例为1～2∶1～2∶1～2，包括但不限于1∶1∶1或2∶2∶1或1∶1∶2。

6.一种试剂盒，其中包括权利要求3至5任一项所述的基因工程制剂和ELISA检测所需的包被缓冲液、洗涤缓冲液、酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗牛IFN-γ单抗等试剂。

7.一种制备权利要求3所述基因工程制剂的方法，该方法包括：(a)用权利要求1所述的引物PCR扩增获得3种编码基因；(b)用大肠杆菌为宿主细胞重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋白；(c)将步骤(b)获得的3种蛋白按比例混合得到所述基因工程制剂。

8.权利要求7所述的制备方法，其中步骤(b)获得的3种重组蛋白分别具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列。

9.权利要求7或8所述的制备方法，其中步骤(b)中的用大肠杆菌为宿主重组表达的具体操作为：将含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的重组质粒PET分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL PBS(pH 7.4)洗涤两次，10ml PBS(pH 7.4)重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清，蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS(pH7.4)缓冲溶液中。

10.一种基因工程制剂介导的牛结核病诊断方法，其中包括(a)剃毛后测量牛颈部上1/3处皮肤厚度；(b)向测量部位施用权利要求l至3任一项所述的诊断试剂；(b)72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。