[发明专利]H1亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及H1亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。

背景技术

禽流感（Avian Influenza,AI）是禽流行性感冒的简称，是由正粘病毒科流感病毒属A型禽流感流行性感冒病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）传染病。根据A型流感病毒表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性不同，禽流感病毒（AIV）可进一步分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚型和9种NA亚型。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒，病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。AIV基因组的分节段特性使得两种或两种以上不同亚型流感病毒共同感染一个细胞时，子代病毒在装配时其核酸片段可能以同源交换的形式发生基因重排而导致抗原转变，从而产生能引起大流行的新流行株。人类历史上几次大流感的流行毒株（H2N2、H3N2）均是禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排而产生，而H1N1亚型AIV传播给人直接导致了1918年世界范围内的毁灭性人类大流感流行。当前流行的甲型H1N1流感病毒的部分基因也来源于AIV。因此H1亚型AIV虽为低致病性AIV,但具有重要的公共卫生学意义。加强H1亚型AIV的检测和监测，对保障人类健康意义重大，而快速简便特异的检测技术有助于H1亚型AIV的早期大规模诊断。

目前禽流感病毒常采用的检测方法包括病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Gene chips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，通过逆转录环介导等温扩增反应（RT-LAMP）就可以完成RNA的检测。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。

本发明所提供的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1和简并引物LB-H1组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

所述成套引物中，各简并引物的摩尔比可为：1.6μmol所述简并引物FIP-H1、1.6μmol所述简并引物BIP-H1、0.2μmol所述简并引物F3-H1、0.2μmol所述简并引物B3-H1、0.8μmol所述简并引物LF-H1、0.8μmol所述简并引物LB-H1。

所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是简并引物中各种单链DNA摩尔数之和。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。

本发明所提供的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg²⁺、反转录酶和上述检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。