[发明专利]提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：

一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA；三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体pET-P_lac分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体pET-P_lac连接，获得重组载体pET-P_lac-dctA；五、以重组载体pET-P_lac-dctA为模板进行PCR扩增，构建P_lac-dctA-T7片段，然后将P_lac-dctA-T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的P_lac-dctA-T7片段和酶切后的pTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-P_lac-dctA；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-P_lac-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物P1为5′-CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3′，下游引物P2为5′-GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3′；步骤五中PCR扩增所用上游引物P3为5′-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3′，下游引物P4为5′-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3′。

2.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中目的基因dctA的双酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴保温3小时。

4.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中重组质粒载体pET-P_lac的双酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴保温3小时。

5.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中连接反应体系如下：

连接反应条件：16℃水浴保温过夜。

6.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。

7.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中P_lac-dctA-T7片段单酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴保温3小时。

8.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中pTR102质粒载体单酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴保温3小时。

9.根据权利要求1所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中连接反应体系如下：

连接反应条件：16℃水浴保温过夜。