[发明专利]分析VC生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种分析维生素C生产菌株混菌传代培养过程小分子代谢物变化的方法。

背景技术

随着经济发展和人民生活水平的提高，维生素C(VC)在食品、药品等方面的需求逐年增加。目前，我国多为“二步发酵法”生产维生素C。第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。其中，第二步发酵中巨大芽孢杆菌为伴生菌，氧化葡糖杆菌为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力得到提高，但其作用机理尚不明确。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分析检测维生素C生产菌株传代培养过程中小分子代谢物变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，包括如下步骤：

（1）混菌传代培养：

①固体培养：

取保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-5个时间取样，取3-5个样；

③分纯：

将步骤（1）②获得的3-5个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养10-15h；

（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：

①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液100–200mL，分别在1000–3000rpm离心3–10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2–7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1–3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；

②将步骤（2）①所得细胞制成干粉，各称取30–60mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入0.5–1.5mL提取液，加入30-70μL浓度为0.020-0.060mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；1000–3000rpm离心3–10min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；

③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入40-100μL浓度为10-30mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

所述提取液为体积分数为50-70%的甲醇水溶液；

④GC-TOF/MS检测：