[发明专利]一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体的说，本发明涉及一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒及其使用方法。 

背景技术

香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带重要的经济作物和粮食作物。香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)是制约我国广东、云南、海南等香蕉主要种植地区产业健康发展的重要因素之一。感病植株生长早期发病病株明显矮缩，叶片狭小，直立状，叶缘黄化，叶质硬脆，易折断，主脉和叶柄表现长短不一，断断续续的深色条纹(俗称“起青筋”)。孕穗后发病，如叶片已出齐，则不现“束顶”，叶片也不狭小、黄化，但幼嫩叶片主脉仍现“青筋”，抽出的花蕾直生，不结蕉或结蕉性能极差，把柄细长、弯曲，果小而少，果端细如指头，果肉脆、无香味。香蕉束顶病的病原为球状粒体病毒(BBTV)，由香蕉蕉脉蚜(Pentalonia nigronervosa)以持久性方式传播。香蕉束顶病主要是通过吸芽和组培苗带毒，以及香蕉交脉蚜(Pentalonia nigroneryosa)来传播。 

香蕉主要通过无性组织培养工厂化生产，香蕉束顶病毒可随着组培中香蕉分化芽的繁殖，若种苗(或蕉头)携带香蕉束顶病毒又未经严格检疫，其病原就可能随组培苗以更快的速度传播，成为传播病毒的一个重要的初侵染源。因此，建立一套BBTV快速、稳定的检测方法是无毒种苗生产的重要保证。 

近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测香 蕉束顶病毒，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(2～3小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实际检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。因此，将生物技术发展的最新成果应用于香蕉束顶病毒检测，具有重要意义。 

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒。 

本发明的目的还在于提供该香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法。 

为了实现本发明的目的，本发明提供一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括： 

由两对引物构成的引物混合液，所述两对引物为：外引物1-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1(5’-TGATGCGGGATGAGTTTA-3’)所示，外引物2-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2(5’-CACGCATATCCTGTATGAC-3’)所示，内引物1-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3(5’-CTTTCGTTTCTCAAGGTGTGCGTCGAGATGAAGAGAAGAAG-3’)所示，内引物2-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4(5’-GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3’)所示，所述内引物1-FIP和所述内引物2-BIP的浓度均为40pmol/μl，所述外引物1-F3和所述外引物2-B3的浓度分别为5pmol/μl； 

浓度为8U/μl的BstDNA聚合酶； 

DNA提取液，所述DNA提取液包含：100mM Tris-HCl(pH7.4)、1M KC1、10mM EDTA和2％(w/v)PVPP；