[发明专利]抗口蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体及其制备方法和用途，特别涉及一种抗口蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体。此外，本发明还涉及到该抗体的制备方法、功能鉴定和用途。本发明属于生物技术领域。 

背景技术

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV）引起的以偶蹄动物发病为主的一种急性、热性、高度接触性、烈性动物传染病，是世界范围内对畜牧业发展威胁最大的一种动物传染病。口蹄疫传染性极强、发病率极高，对幼畜的致死率有时可达100%，故被世界动物卫生组织（OIE）列为动物14种A类传染病之首，我国动物卫生部门也将其列为一类传染病。 

FMDV是小RNA病毒科，口蹄疫病毒书的成员，目前已经发现7个血清型，即O、A、C，SAT1、SAT2、SAT2、和AsiaI型，不同血清型之间不存在交叉反应和保护。完整AsiaI型病毒粒子包括衣壳和RNA两部分，其中结构蛋白VP0、VP3和VP1构成病毒衣壳衣壳蛋白是刺激动物机体产生保护性中和抗体的最主要部分，也是区分血清型的抗原表位所在。 

目前，流行口蹄疫国家主要通过接种灭活疫苗作为防止疫病发生的唯一手段。经过了高密度、大范围的不断疫苗接种，疫病流行得到有效控制，但偶蹄兽家畜活体带毒感染动物仍然隐藏在畜群中，是最危险的潜在传染源。消灭口蹄疫的发达国家，通过疫苗免疫和捕杀病原阳性动物的方式达到疾病净化，但世界范围内尔频繁的畜产品自由贸易，使这些国家时刻面临疫病爆发的危险。 

面对如此严峻的疫病形式，建立快速、敏感、特异的病原诊断方法就变得尤为重要。OIE推荐的抗原诊断方法，包括病毒分离、多克隆抗血清为基础的美联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验和病毒核酸检测方法RT-PCR，这些方法需要在具有专门仪器设备、实验室和专业人员的条件下进行操作，同时需要用其余的血清型抗体作为对照。如果能够获得具有某一血清型具有型特异性的抗体，那么就可以 推动对于口蹄疫疫情的诊断速度和准确性，从而及早采取措施控制疾病流行，减少造成的经济损失。 

1993年，Hamers等发现骆驼和鲨鱼等体内存在一种天然缺失轻链，仅有重链的抗体，称为重链抗体（HCAbs）。这类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区单域结构域组成，称为单域重链抗体（variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH）。虽然缺失可变区，VHH却仍同普通抗体一样保持着良好和特异的抗原结合能力，它是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量仅为15kD，是常规抗体的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体（nanobody）。该类抗体具有伸展的抗原互补结合区以及更高的组织穿透性和更小的分子个体，可以结合一些常规抗体无法接触的抗原表位，充分发挥抗体的生物学功能。另外，VHH具有易表达、水溶性好、耐高温、耐极度pH值等独特性质，其作为小型化基因工程抗体在基础研究、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。目前，骆驼VHH单域重链抗体研究在欧美国家已成为研究热点。Lorena利用轮状病毒VP6蛋白免疫羊驼获得了具有中和活性的VHH，能够用来治疗小鼠腹泻。早期诊断和治疗效果跟踪始终是癌症诊断的研究热点和难点。Cortez-Retamoz利用小分子量VHH具有良好组织渗透性、高亲和力和不损伤正常组织的特性，以其作为显影剂可在体内快速而准确检测肿瘤位置。由于VHH均具有高抗原特异性和亲和力，可用于靶向肿瘤特异抗原，将肿瘤治疗药物直接作用于病灶，发挥有效的杀伤肿瘤作用。国内在骆驼VHH研究仍处于起步阶段。严安等利用H5N1禽流感病毒抗原免疫羊驼，构建了抗H5N1VHH免疫库，并初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1VHH抗体，为H5N1的早期诊断和临床治疗奠定基础。利用双峰驼制备Asia I型免疫抗体库，从而筛选得到能够与口蹄疫Asia I型病毒抗原特异性结合VHH重链抗体，来研制病原快速诊断方法在国内外尚无报道。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗口蹄疫AsiaI型病毒的双峰驼VHH重链抗体； 

本发明的目的之二是提供编码所述双峰驼VHH重链抗体的核苷酸序列； 

本发明的目的之三提供所述的双峰驼VHH重链抗体或其编码序列在制备检测口蹄疫AsiaI型病毒试剂中的应用。 

为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段：