[发明专利]一种环化抗菌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种环化抗菌肽其制备方法以及在制备治疗细菌、真菌感染的药物中的应用，该环化抗菌肽对细菌和真菌及其耐药菌株有比果蝇肽更显著的杀菌活性。 

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，其分子量在2-7KD左右，随着研究的深入，抗菌肽已成为生物医药和农牧领域研究热点。迄今为止，已有几百种抗菌肽分别在动物、植物、微生物和人体中被发现，它们具有对细菌、真菌的广谱杀菌作用。 

昆虫具有极强的适应能力和防御能力，在地球上广为分布。昆虫的幼虫能在腐烂潮湿的环境中生长，而成虫通常成为传播微生物(包括动植物病原微生物)的载体，这主要是因为昆虫具有强大的先天免疫系统。昆虫的先天免疫包括细胞免疫和体液免疫。当外来物突破昆虫第一道由外表皮组成的物理防线后，就可激活体内产生一系列的应答，包括血细胞的包围、吞噬及伴随的黑化反应(称之为细胞免疫)，以及抗菌肽的合成和分泌。果蝇肽(Dorsocm)氨基酸序列为：Gly-Lys-Pro-Arg-Pro-Tyr-Ser-Pro-Arg-Pro-Thr-Ser-His-Pro-Arg-Pro-Ile-Arg-Val，它是从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中分离出来的一种天然抗菌肽。 

尽管已有报道和研究果蝇肽对微生物表现出非常有效的广谱抗菌活性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌，而且没有溶血性。由它合成的环化抗菌肽——果蝇肽截短环化肽(命名为DTCP)活性更强，因而更适合生物医药和农牧行业应用。 

本发明对果蝇肽序列进行改造，获得了环化抗菌肽-果蝇肽截短环化肽(DTCP)。 

发明内容

本发明目的在于提供一种环化抗菌肽及其制备方法。为了实现上述目的，本发明采用固相合成方法获得式I结构的DTCP。为了实现上述目的，本发明公开了所述DTCP的应用，所述DTCP具有抑制细菌和真菌的作用。 

利用Pioneer多肽合成仪(美国应用系统生物公司)制备本发明所述的DTCP，利用96孔板法检测多肽的杀菌活性，结果表明本发明的DTCP杀菌活性强于果蝇肽的杀菌活性。 

抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用 方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了DTCP对人体红细胞的溶血活性，实验表明，DTCP溶血率值很低，证实本发明环化抗菌肽的溶血毒性极小。 

此外，又对本发明DTCP进行动物体内急性毒性试验，证明DTCP无毒性作用。又进行DTCP对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作用的试验，表明DTCP对金黄色葡萄球菌感染有显著的抑制作用。 

本发明具有如下优点：本发明DTCP比果蝇肽的杀菌活性有较大提高，具有更高效抑菌效果，可以抑制动物体内多种致病菌，并且无溶血毒性，因此本发明环化抗菌肽可应用于制备细菌或真菌感染引起的疾病的药物。 

附图说明

图1是DTCP质谱图 

表1是DTCP对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC) 

表2是DTCP溶血活性检测结果 

具体实施方式

实施例1DTCP的制备 

采用固相化学法合成DTCP，仪器为Pioneer多肽合成仪。合成具体步骤包括TFA剪切、反向柱纯化、质谱鉴定。具体步骤如下： 

DTCP序列为 

制备从C-端到N-端逐个合成，由仪器自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Lys的树脂(美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min，二甲基甲酰胺 清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。 

取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000rpm，离心10min，收集沉淀并室温干燥。