[发明专利]一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法及类家蚕丝素蛋白非结晶区基因任意倍数的克隆方法。

背景技术

家蚕丝素蛋白，又称丝素蛋白，是一种结构蛋白，由包括丝素重链（H链）蛋白、丝素轻链（L链）蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，属于结晶高聚物，分为结晶态和无定形态两大部分。其中，丝素蛋白重链是丝素蛋白的主要部分，全长5363个氨基酸，包括20种氨基酸，富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，其主要包括N末端151个氨基酸残基的非重复区域、核心区域和C末端55个氨基酸残基的非重复区域三个组成部分。而丝素重链的核心区域又分为富含甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）的高度重复区域和非重复的间隔区，其中，高度重复区域内一般以GAGAGS重复开始，以GAAS终止。非重复间隔区，又称非结晶区，主要为GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFG的非重复序列。

研究表明家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中主要为亲水性氨基酸，其编码的多肽用作美容用品应具有比丝素粉更优的护肤保湿的功效，但是家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中含有光照易生色的酪氨酸和色氨酸，不适合用作护肤品。为了使家蚕丝素蛋白非结晶区能获得更好的应用效果（如护肤品、敷料类生物材料等的功能肽），本发明人设计了去除了家蚕丝素蛋白非结晶区中的酪氨酸和色氨酸的编码的多肽，其氨基酸序列为GSSGFGPVANGGSGEASSESDFG，命名为类家蚕丝素蛋白非结晶区。

为了更好地研究类家蚕丝素非结晶区及其应用，需要获得大量的高纯度的类家蚕丝素非结晶区的蛋白及不同聚合度类家蚕丝素非结晶区的蛋白。采用合成肽的方法获得类家蚕丝素非结晶区的蛋白价格昂贵，不适合类家蚕丝素非结晶区蛋白的大量生产。另一方面由于类家蚕丝素蛋白非结晶区的氨基酸发生了改变，使类家蚕丝素蛋白非结晶区基因不同于与家蚕丝素蛋白非结晶区基因，因此按照现有的基因工程技术利用现有的家蚕丝素的cDNA为模板进行克隆，有误差，无法获得与类家蚕丝素蛋白非结晶区核苷酸序列一致的目的片段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简便，准确性高的克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，包括以下步骤：

A、合成分别编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link1、Link2、Link3三个双链DNA分子；其中Link1的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基；

B、将Link1、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，NheI/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得。

本发明通过对类家蚕丝素重链核心区的非结晶区氨基酸序列及其编码基因的分析，将类家蚕丝素非结晶区氨基酸序列分为如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3所示的三段氨基酸序列，设计了编码SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的Link1、Link2、Link3三个双链DNA分子。本发明所述Link1、Link2、Link3三个双链DNA分子的5’端和3’端含有可以配对的同尾酶，如Link1的3’端限制性核酸内切酶NheI与Link2的5’端限制性核酸内切酶SpeI是一对同尾酶；Link2的3’端和Link3的5’端也是一对同尾酶NheI/SpeI。当三段基因连接后，两对同尾酶的位点NheI和SpeI被限制性内切酶切除后连接，形成符合非结晶区氨基酸的丙氨酸Ala和丝氨酸Ser的三联密码子。

优选的，所述将Link1、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括：

a、用限制性核酸内切酶NheI/BglII消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Link1混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL1；