[发明专利]AIF1蛋白及抗体在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及AIF1基因、蛋白及其抗体在制备牡蛎抗感染免疫制剂中的作用。

背景技术

同种异体移植炎症因子AIF -1 (Allograft inflammatory factor-1)是一种分子量约为17kD，可被γ干扰素诱导的钙结合蛋白。目前，AIF1已在多种物种中被报道，其氨基酸序列具有高度的保守性，在结构上含有一个保守的EF-hand结构域。研究证明AIF1是巨噬细胞活化过程中的免疫调节因子，能够促进巨噬细胞的增殖和迁移，并且具有多项生物学功能，参与机体免疫排斥、免疫炎症反应、自身炎性和非炎性损伤，并与多项疾病的发生发展相关。

牡蛎是重要的海水养殖经济贝类，具有“海洋牛奶”之美誉，其肉质细嫩、肉味鲜美、营养价值高，是世界性的水产佳肴。我国是水产大国，牡蛎等贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，其中我国牡蛎养殖年产量居世界首位，达到300多万吨（湿重），占我国海水养殖总产量（约1000万吨）的约三分之一（联合国粮农组织（FAO）统计数据）。牡蛎养殖业的迅速发展为我国农业经济作出了重要的贡献，也极大的改善了沿海渔民的生活水平，但是近年来，随着牡蛎种质退化，养殖规模的不断扩大，养殖环境的恶化和养殖模式的局限性，牡蛎养殖病害频发，造成了巨大的经济损失，极大的损害了当地渔民养殖积极性，限制了牡蛎产业进一步的发展。其中研究证实类立克次体（rickettsia-like organism,简称RLO) 是其主要病原之一，因此研究牡蛎抗RLO感染相关细胞因子及其抗感染机制显得尤为重要和迫切，将有助于牡蛎抗感染免疫制剂的开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足之处，提供AIF1基因、蛋白及在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用。

为解决技术问题，本发明是通过这样的技术方案来实现的：

本发明提供了一种近江牡蛎AIF1基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

本发明进一步提供了用于编码前述蛋白质的基因，该基因的编码框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还揭示了前述蛋白质在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用，是将所述蛋白质免疫新西兰大白兔进而获得多克隆抗血清。

本发明还提供了前述蛋白质制备的多克隆抗血清（即AIF1蛋白的多克隆兔抗体）在抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌细胞壁成分——脂多糖（Lipopolysaccharide，简称LPS）引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明获得了近江牡蛎AIF1基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的AIF1蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌LPS引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡的作用。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明中近江牡蛎AIF1基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。用于编码前述蛋白质的基因的编码框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

前述蛋白质在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用，是将所述蛋白质免疫新西兰大白兔进而获得多克隆抗血清。该多克隆抗血清（即AIF1蛋白的多克隆兔抗体），应用在抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌细胞壁成分——脂多糖（Lipopolysaccharide，简称LPS）引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡中。

本发明的实现步骤包括：

1、以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，构建cDNA文库，获得AIF1的基因编码框核苷酸序列。

2、利用DNA重组技术将AIF1基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD19-T载体（Takara公司，日本）中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32(a) 原核表达载体（Novagen公司，德国）连接，获得重组表达质粒pET-32(a)-AIF1。

3、将阳性重组质粒PET-32(a)-AIF1转化到表达宿主菌BL21（DE3 ）( 天根公司，中国），异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）(Sangon公司,加拿大)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。

4、将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质。