[发明专利]一种检测IL-2-HSA的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

一种检测IL-2-HSA的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对样品中IL-2-HSA含量的检测，属于时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术领域。

背景技术

白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)是相对分子质量为15kD的糖蛋白，在体内由T细胞产生，通过促进T细胞的增殖，增强人体的免疫力。IL-2作为一种多功能的免疫调节因子，已经成为临床治疗肿瘤和自身免疫性疾病的一种引人注目的生物制剂。但IL-2在体内的半衰期仅为6.9min，为了达到良好的治疗效果，需要频繁大剂量用药，不但增加病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的不良反应，因此长效多肽蛋白药物的研究受到越来越多的关注。其中IL-2与人血清白蛋白(human serum albumin，HAS)的融合蛋白(IL-2-HSA)增大了IL-2的相对分子质量，减少了IL-2的免疫原性，从而减少肾小球滤过率和体内清除率，可以有效提高IL-2在体内的半衰期，具有广阔的生产和临床应用前景。在随后的药动学研究和临床应用中迫切需要一种微量测定方法能够对完整的IL-2-HSA融合蛋白进行检测。

时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。时间分辨荧光免疫分析法其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu³⁺标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。TRFIA是以稀土离子标记的免疫分析方法，以其高灵敏度和高精确度广泛用于超微量检测中。TRFIA采用小分子的离子标记而不是大分子的酶，因而标记位点多，对生物活性影响小，通过增强液100余万倍的信号放大，可极大地提高方法学的灵敏度和稳定性；采用针对IL-2及HSA 的不同抗体，建立定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心TRFIA方法，样品中的IL-2或HSA都检测不出，只有含完整的IL-2-HSA融合蛋白时可以有效检测出其含量。建立的TRFIA试剂盒有效期长、操作流程短、操作简便快速、灵敏度高、检测成本低、标准曲线量程宽，可全自动操作，适合对大批量样品的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测IL-2-HSA的试剂盒及其检测方法，用于样品中IL-2-HSA含量的检测。

本发明的技术方案：一种检测IL-2-HSA的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，主要采用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）检测IL-2-HSA。该检测IL-2-HSA的试剂盒由1、96或48孔包被有抗IL-2的单克隆抗体的包被板，2、反应缓冲液，3、IL-2-HSA标准，4、兔抗HSA抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液和7、增强液所组成。

用所述的试剂盒检测IL-2-HSA的方法，取包被有抗IL-2的单克隆抗体的微孔板，加入IL-2-HSA标准或样品，加入兔抗HSA抗体。反应后洗涤，没有连接的IL-2-HSA及抗体被洗涤除去，再加入Eu³⁺-羊抗兔抗体，标记免疫反应后再次洗涤，没有连接的Eu³⁺-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的IL-2-HSA浓度成正比，对照标准曲线即可确定被测样品中IL-2-HSA的含量。

所述的检测IL-2-HSA的方法，具体操作为取包被有抗IL-2的单克隆抗体的微孔板，加入50μL的IL-2-HSA标准或样品到各自的微孔中，加用缓冲液1︰20稀释的兔抗HSA抗体50μL，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加用缓冲液1︰20稀释的Eu³⁺-羊抗兔抗体100μL，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量；从标准曲线计算样品中的IL-2-HSA含量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、特异性强、测量范围宽、灵敏度高。

附图说明

图1 IL-2-HSA-TRFIA反应示意图。

图2 检测IL-2-HSA的TRFIA试剂盒示意图。1、96或48孔包被板，2、缓冲液，3、IL-2-HSA标准，4、兔抗HSA的抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。

具体实施方式

实施例1  制备试剂盒和检测样品

Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备：