[发明专利]一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法

说明书

技术领域

本发明设计绵羊18号染色体末端微卫星标记UMP基因型，分型检测方法，可以快速高效预测陶赛特羊早期生长发育性状，建立了该微卫星标记基因型分型的检测方法。

背景技术

1983年，在美国的无角陶赛特羊群体中发现了一只后臀极度发达的个体，人们称这种表型为双肌臀性状，根据表型将该基因命名为Callipyge（CLPG）基因， 20世纪末，人们将CLPG基因初步定位于陶赛特羊第18号染色体的末端区域，位于微卫星标记CSSM18和TGLA122之间。

文献检索披露：1）Journal of Animal Science,76(1998), 2549- 2559，作者：Freking等研究发现CLPG基因可显著提高双肌臀羊的瘦肉率，也使皮下肌间、肌内和肾周的脂肪减少，能显著提高屠宰率。2）Genetics, 163(2003), 453-456,作者：Maria等研究发现在CLPG基因内的DLK1和GTL2位点间存在一处碱基突变（A-G）可以决定CLPG表型。3）国内南京农业大学刘国庆等研究陶赛特羊和萨福克羊及其杂交后代CLPG基因多态性，发现18号染色体Meg3.9位点与肉羊后臀肌肉发达的表型相关，详见论文《遗传》，28（2006），815-820。4）《遗传》，28（2006），1525-1531，作者：任航行等分析了与CLPG基因连锁相关的10个微卫星基因座（( ILSTS54、TGL A337、HH47、TGLA122、BP33 、OB2、BM3413、MCM38、MC MA26和CSSM1）等分别对陶赛特羊和萨福克羊群体的遗传进行了分析，结果显示：在陶赛特群体中，微卫星BM3413、MCMA26和CSS M18对臀宽有显著影响； 萨福克群体中微卫星基因座TGLA122、BM3413、MCM38和CSSM18对绵羊臀宽存在显著或极显著影响。随着测序技术的发展，绵羊基因遗传连锁图谱也在不断的完善和增加。2010年10月6日第五代绵羊连锁图谱发布，该图谱包含了染色体上的673个DNA标记，连锁群的总遗传长度已经超过3000cM。

本发明研究位于绵羊18号染色体末端UMP微卫星基因座的多态性，在陶赛特羊上发现其微卫星基因座的多态性与早期生长发育具有相关性，可以将该微卫星位点作为影响陶赛特羊早期生长发育的分子标记。

发明内容

本发明的目在于：提供通过绵羊18号染色体末端的微卫星标记UMP快速检测陶赛特羔羊生长发育性能的方法，对预测陶赛特羊的生长发育速度及性能有着重要的科学价值与实践意义。

本发明的目是这样实现的：一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法,包括1）依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93.9cM位置的微卫星标记UMP；2）人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物： 5'- CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3'；反向引物： 5'- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3'；上下游引物长度分别为24bp和23bp；3）采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4）利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP的基因型分别是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107；

    其中绵羊基因组DNA体外扩增

采集羊外周血液1.5ml，使用肝素纳抗凝采血管， -20℃冷冻保存，提取基因组DNA；

    其中绵羊血液基因组DNA的制备：

   （1）取出-20℃冷冻血液0.5-1.0 ml，在室温下完全融化，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液，中含裂解的红细胞；加入1ml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟，弃去上层液；再加入1ml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟，弃去上层液；

   （2）向管内依次加入600μl的白细胞裂解液，70ul的10% SDS溶液 ，15ul浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul浓度为10mg/mL 的Rnase A溶液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀；置于55℃振荡水浴锅中振荡过夜；