[发明专利]一种喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学分析技术领域，具体涉及一种喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法。

背景技术

喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌，由于其在饲料及饲料添加剂中滥用所引起的食品安全问题备受关注，对喹乙醇及其残留标示物3-甲基喹喔啉-2-羧酸（MQCA）残留快速检测试剂盒和胶体金试纸条的研究成为近年来国内热点。3-甲基喹喔啉-2-羧酸为小分子物质，不能刺激动物机体产生免疫应答获得抗体，需与大分子物质如牛血清白蛋白、卵清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白等联接作为免疫全抗原。研究发现半抗原能否刺激机体产生高特异性的抗血清不仅决定于它与蛋白质的结合位点，而且取决于蛋白质上连接的半抗原数目。已有的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原合成方法都选用N,N'-二环已基碳二亚胺（DCC）作为催剂，但该催化剂的缺点是合成过程中容易产生的副产物N,N'-二环已基脲且不易除净，该副产物对皮肤、眼晴有刺激性，引起发炎，所得全抗原的偶联比一般只有10：1左右。目前国内尚未建立合理、可靠的喹乙醇残留标示物全抗原偶联比检测方法，其偶联比的测定方法主要为紫外分光光度法，该方法的专属性不强，准确度不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全性好、效率高、高偶联比的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法。

本发明获得3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法如下：

在N,N'-二异丙基碳二亚胺存在下，3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，反应产物再与载体蛋白偶联，得到全抗原。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白。

合成路线为：

具体的合成过程为：将3-甲基喹喔啉-2-羧酸溶于二甲基甲酰胺中，再加入催化剂N,N'-二异丙基碳二亚胺，催化剂与3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩尔用量相等，然后加入过量的N-羟基琥珀酰亚胺，与其发生酯化反应得到酯化物。反应后，离心除去沉淀物，再向反应液中滴加溶有载体蛋白的pH为7.4的PBS缓冲液，酯化物与载体蛋白分子上的胺基发生偶联反应得到全抗原。反应液置于超滤管中，离心、洗涤，除去未反应完全的小分子物质，采用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤。

进一步，所述3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔用量比为1：（1.5～2），优选1：1.6。

酯化反应时的反应温度为30～45℃，优选37℃。

偶联反应时的反应温度为30～45℃，优选37℃。

采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的偶联比的检测方法：将上述含全抗原的反应液置于超滤管中，离心、洗涤，收集滤液，采用高效液相色谱法检测滤液中游离3-甲基喹喔啉-2-羧酸的浓度，色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比为60:40的甲醇水混合液，检测波长为320nm。

采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原用于制备喹乙醇残留标示物ELISA检测试剂盒。

本发明有益效果：

（1）本发明在合成3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原所用的催化剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC），反应时较易形成均相反应，与催化剂N,N'-二环已基碳二亚胺（DCC）相比，其副产物少，安全性更高，不易造成操作人员的过敏，且最终所得的全抗原偶联比可由10左右提高到32～68；

（2）在以往实验中都采用透析法除去反应中的有害物质和杂质，通常需要在4℃，透析2～4天、PBS缓冲液4～8L。本发明应用分子截留量为30 000dal的超滤管离心纯化MQCA全抗原，所需时间短，且耗费PBS缓冲液仅需4～8mL，为准确测定全抗原偶联比提供了可行性。

（3）本发明选用高效液相色谱法检测全抗原的偶联比，该检测方法的精密度符合要求，RSD=0.23%；重现性良好, RSD=1.14%。