[发明专利]一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括：

由两对引物构成的引物混合液，所述两对引物为：外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，内引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，内引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示，所述内引物1-CMV-FIP和所述内引物2-CMV-BIP的浓度均为40pmol/μl，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的浓度分别为5pmol/μl；

浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；

8U的反转录酶；

RNA提取液，所述RNA提取液包含：100mM Tris-HCl(pH7.4)、1M KC1、10mM EDTA、和2%(w/v)PVPP；

反应缓冲液，所述反应缓冲液包含：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄、5mM甜菜碱＝8:5:2:10；

核酸染料；

阳性对照：含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA；

阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。

2.根据权利要求1所述的香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为1000×SYBR Green I。

3.一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤：

1)被检样品的RNA核酸提取：向0.5mg待检测样品中加入30μlRNA提取液，研磨成糊状后，在95℃10min，10000rpm下离心2分钟，取上清作为检测模板RNA；

2)环介导等温扩增反应：

在25μl PCR管中配置反应溶液：1μl的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；1μl的外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；1μl的内引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；1μl的内引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；12.5μl的反应缓冲液；8U的Bst DNA聚合酶1μl；8U的反转录酶0.2μl、2μl的模板RNA；

然后加水至25μl；设置阳性对照反应时，用含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA代替1)中得到的检测模板RNA，设置阴性对照反应时，用100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA代替1)中得到的检测模板RNA，将含有配制好的反应溶液的PCR管于63℃恒温反应90min；

3)分析判断反应产物结果：在2)中所得产物中加入1μl的核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

4.根据权利要求3所述的香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述核酸染料为1000×SYBRGreenI。