[发明专利]HR-HPV E6/E7基因SNP检测的固相芯片和探针以及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，具体是涉及HR-HPVE6/E7基因SNP检测固相芯片和探针引物以及检测试剂盒。 

背景技术

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发病的必要因素，已经在99.7％的宫颈癌组织中证实HPV DNA的存在。大量研究已证实，高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染和特定的HR-HPV型内变异体(对某一特定的HPV型别，与原型相比其基因组的编码区有小于2％差异，非编码区小于5％的差异)能增加宫颈癌(CC)及宫颈上皮内瘤变(CIN)的发病危险。 

目前，宫颈癌发生的三步模式是：HPV感染，高级别癌前病变的进展，宫颈癌。因此，HPV检测能做到更早期的发现具有潜在病变危险的病人，从而做到早期的诊断和治疗。宫颈癌是世界卫生组织建议在全世界范围内开展筛查的唯一恶性肿瘤，是目前唯一通过常规筛查几乎完全可预防因此得到早期治疗的疾病。 

从1941年巴氏细胞涂片技术开始用于临床常规筛查，但是这项技术的准确性却受到标本收集、制备、染色和阅片等很多方面的影响，使其检测潜在癌前病变的敏感性仅有50％左右，为了克服其敏感性低的缺点，液基细胞学(LBC)取代传统涂片成为标准初筛方法，但有文献经过Meta分析表明无论是在检出率还是在降低样本的不满意度上LBC并未优于传统涂片，并且细胞学为基础的筛查方法具有高度的主观性并且具有资源和劳动力密集型的特点，因此，在资源缺乏的地区不适合采用。肉眼检测包括醋酸白实验(VIA)和碘染色法(VILI)是一种经济有效的筛查方法，但敏感性低，主观性强。因此，改进目前已存在的筛查技术就尤为重要。 

在那些宫颈细胞学无异常的妇女中，HR-HPV阳性妇女患CIN2-3和原位癌的风险是未检测到HPV妇女的58-71倍。HPV-DNA检测克服了细胞学筛查的主观性，最近的研究表明HPV检测作为一种初筛方法在检测癌前病变上比细胞学具有更高的敏感性(高于25-35％)和阴性预测值，但特异性(5-10％)和阳性预测值较细胞学低，因此，寻找一种能增加HPV-DNA检测特异性的方法很有必要。 

最近越来越多的流行病学的数据表明HR-HPV基因组型内变体通过改变转化能力或是免疫反应能力影响HR-HPV的致癌力。HR-HPV特定的型内变异体与病毒持续感染和宫颈病变进 展关系密切，并且存在地区差异。目前对HPV16、HPV18、HPV58和HPV52变体研究的最多，如有研究表明，在瑞典、意大利和法国人群中，HPV16E6L83V与HPV持续感染、宫颈癌及宫颈高级别瘤变的发展相关，而在日本和中国人群中，HPV16E6D25E与宫颈癌及宫颈高级别瘤变的发展相关。 

以上的研究提示，将HPV型内基因组变异体作为生物学标记，即通过检测HR-HPV阳性病人的病毒基因组变异来预测其发展为持续感染和引起宫颈病变的危险性是合理的、可行的，并且可以弥补单纯HPV-DNA检测特异性和阳性预测值低的缺点。我们之前的研究也表明某些特定的E6/E7变异可能有更高的致癌性，具体详见文章(Gynecol Oncol 2010；119：436-43 Int J Gynecol Cancer 2010；20：1391-8)。 

中国发明专利申请(申请号：201010151982.6申请日：2010-04-20)公开了检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒，基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；包括27种HPV亚型特异性探针，对应包括了22种高危及中危型HPV，5种低危型HPV和2种高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。该专利包含的基因芯片是针对亚洲地区常见的HR-HPV16、58、18、52四种型别的E6/E7基因变异位点构建含有特定SNP位点的芯片，通过此芯片不仅可以检测样品中存在的HR-HPV16、58、18、52四种亚型，而且最主要的是检测四种亚型E6/E7基因特定位点的变异情况(野生型或突变型)。本发明所建立的基因芯片是针对HPV类型设计的，探针设计在L1区域，主要检测样品中的HPV亚型(如HPV6、11、16、18、31、33等)。 

发明内容