[发明专利]PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒。

背景技术

随着规模化养猪的不断发展，当前猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）造成的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。PRV、PCV-2和PPV的混合感染，仅根据临床症状较难进行鉴别诊断，而且PRV基因缺失疫苗的大规模应用，使野毒感染和疫苗接种的区分十分必要。目前，主要的检测方式有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法，而针对PRV基因缺失疫苗有gE-ELISA以区分野毒感染和疫苗接种。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。

发明内容

本发明的目的是：提供一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它可以同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低。

本发明是这样实现的：PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL；PRV引物的目的基因为gE，PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1：5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’， PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2：5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ，片段大小为288bp；PCV-2引物的目的基因为ORF2，PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1：5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2：5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，片段大小为419bp；PPV引物的目的基因为VP2，PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1：5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2：5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ，片段大小为681bp。

缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。

PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的Poymerase/uL。

PRV引物的上游引物为PRV-1，下游引物为PRV-2、 PCV-2引物及PPV引物

为了验证本发明的效果进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1 病毒和细菌

PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114、PRRSV美洲株 CH-1a株均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送；PRV（gE基因缺失Bartha-k61株）购自山东绿都生物科技有限公司；大肠杆菌为本研究室保存。

1.2 主要试剂

Goldview、Tris缓冲液、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。

1.3 引物设计

根据GenBank中登录的（PRV)）gE、PCV-2 ORF2和PPV VP2基因组序列，应用DNAStar软件，设计了3对引物，用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列（见表1）。

1.4 病毒核酸的抽提

取待检样品肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg，加入500μl PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于－70℃保存。

1.5 单一病毒PCR扩增