[发明专利]一种免抽提虹彩病毒PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种快捷方便的鱼虹彩病毒的检测方法。

背景技术

本发明是一种快捷方便的虹彩病毒PCR检测方法。虹彩病毒是造成渔业生产中巨大损失的一种致病病毒，致死率高达60%以上。及早发现并确诊虹彩病毒，可以预防并有的放矢的治疗鱼虹彩病毒感染疾病。这在渔业生产中具有非常大的意义。

虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物，是大型20面体状DNA病毒，分为虹彩病毒属(Iridovirus)，绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，蛙病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。在水产业中造成巨大损失的虹彩病毒有红鲷鱼虹彩病毒(red sea bream iridovirus)、台湾石斑鱼虹彩病毒(Taiwan Grouper iridovirus)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus)和大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus)。

病毒类疾病没有有效的药物来控制，在目前阶段，早预防早发现尽早采取隔离和消毒手段是唯一有效的处理措施。

本发明是一种快捷简便的虹彩病毒检测方法。相关PCR试剂为上海七海复泰生物科技有限公司产品。病理组织不用经过提取DNA处理，直接PCR检测，半个小时即可得到检测结果。

发明内容

本发明的目的是建立一种新的DNA病毒检测方法。该方法能够经济、快速地检测出鱼类虹彩病毒。

本发明建立的新的PCR检测方法，包括以下内容：

a) PCR扩增目的片段；  

b) 琼脂糖DNA电泳检测目的片段；

c) 或者在PCR反应体系中添加荧光染料SYBR GREE，用于实时定量PCR。

该虹彩病毒PCR检测方法与其他检测方法相比具有如下优点：

a) 简便，不需要处理病理组织，不需要抽提DNA；

b) 快捷， 30-60分钟便可得到结果；

c) 经济，节省了样本制备的费用；

d) 便于大规模样本筛查。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1 1.2%琼脂糖电泳图。泳道1是DNA Marker DL2000，泳道2是空白对照，泳道3是扩增的PCR产物。

图2  RT-PCR图。图A是空白对照，图B是扩增的目的片段。

具体实施方式

实施例1：基于琼脂糖电泳的检测方法

0.2mL PCR管中，加12.5uL 2X PCR预混液（上海七海复泰生物科技有限公司生产），各加入0.75 uL正反向引物（sense primer: GGCCATGCCAATTTCGG, antisense primer: TGCTGCCGGGCATCAT, 扩增的目的片段是虹彩病毒主要衣壳蛋白上的一段序列），补加11uL 双蒸水，用平头灭菌牙签刮取病理组织，将牙签在PCR管中搅动混合。PCR管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94℃ 5min预变性，94℃ 10s；60℃ 10s；72℃，10s；扩增35个循环。取10uL扩增产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电压200V，10分钟后，紫外凝胶成像系统下观测PCR产物（图1）。泳道1是DNA Marker DL2000，泳道2是空白对照，泳道3是扩增的PCR产物。

 实施例2：实时定量PCR检测方法 

0.2mL PCR管中，加12.5uL 2X qPCR 预混液（上海七海复泰生物科技有限公司），各加0.75 uL正反向引物（sense primer: GGCCATGCCAATTTCGG, antisense primer: TGCTGCCGGGCATCAT, 扩增的目的片段是虹彩病毒主要衣壳蛋白上的一段序列。），补加11uL ddH2O，用平头灭菌牙签刮取病理组织，将牙签在PCR管中搅动混合。PCR管置于荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94℃ 5min预变性，94℃ 10s；60℃ 10s；72℃，10s；扩增35个循环。分析扩增曲线（图2）。图A是空白对照，图B是扩增的目的片段。