[发明专利]利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法

权利要求书

1.利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，包括如下具体步骤

1：选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者Vero；

2：转瓶繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到1个15L转瓶进行培养；48小时左右按照1：4或1：3的比例进行细胞传代培养；

3：收获转瓶中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L转瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；

4：收获的细胞计数后，按照每个微载体添加5-20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入2-10克微载体；

5：生物反应器培养接种细胞：

生物反应器培养细胞的培养基为MEM（Hyclone）；血清使用浓度为7-10%；CO₂通气量为5-10%；溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30-55转/分，pH为6.8-7.4；90-95%以上的微载体在细胞接种后48-72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求；

6：步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，接种禽流感病毒，方法如下：

6.1）清洗微载体：先沉淀长满细胞的微载体，然后用PBS清洗清洗微载体；

6.2）病毒接种：然后加入禽流感病毒-MEM溶液进行病毒接种，病毒接种过程中培养基的体积为生物反应器工作的体积1/4-1，病毒接种剂量为0.00001-1.0MIO，接种过程中不加血清； 

6.3）孵育禽流感病毒与细胞：禽流感病毒接种后，向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，在禽流感病毒与细胞孵育的过程中，轻轻搅拌微载体使细胞与禽流感病毒充分接触，搅拌速度为30-45转/分，禽流感病毒与细胞孵育时间为0.5-10小时；

7：禽流感病毒繁殖    病毒繁殖培养基为MEM（Hyclone）； CO₂通气量为5-10%；溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30-45转/分，pH为6.5-7.2；病毒繁殖的时间为24-72h；

8：离心收集步骤7所得禽流感病毒液，离心速度为3000-4500转/分，离心时间为20-30分钟；

9: 灭活步骤8所得禽流感病毒液中的禽流感病毒

使用甲醛灭活禽流感病毒，加入的甲醛终浓度为0.01%-0.2%,灭活的时间为24小时，灭活的温度为15-37℃；在灭活的过程中进行搅拌使甲醛与病毒混匀；

10：然后按照常规方法制备禽流感细胞苗，即按照油相：水相为2：1的体积比例制备疫苗，先把油相进行灭菌处理，然后把步骤9所得完全灭活的禽流感病毒液慢慢倒入搅拌中的油相，乳化制得疫苗； 

11：禽流感细胞苗免疫21日龄的SPF鸡，免疫剂量为0.3ml，免疫后14天、21天分别采血进行测定血清中抗禽流感特异性抗体的滴度（HI）。

2. 如权利要求1所述的利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，步骤6.3中，禽流感病毒与细胞孵育时间不低于1个小时。

3. 如权利要求1所述的利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，步骤7中，病毒繁殖过程中，当病毒繁殖培养基pH低于6.5或者禽流感病毒HA价高于9.0，就更换部分溶液。

4. 如权利要求1所述的利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，所述微载体为Cytodex I或hyclone。