[发明专利]杀线虫晶体蛋白基因cry003-131及应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物防治和农业微生物基因工程领域。具体涉及一个具有杀线虫活性的杀虫晶体蛋白基因的分离、克隆以及其编码的蛋白在微生物杀虫剂和转基因作物中的应用。 

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一类广泛分布于环境之中的革兰氏阳性细菌，在其生长发育的中后期可以形成内生芽胞，并且伴随芽胞形成的同时，能产生一类对多种昆虫具有特意毒杀活性的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Protein,ICPs)，从而有别于蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus,Bc)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis,Ba)。Bt首次由日本学者于1901年从家蚕幼虫体内分离得到，并于1915年正式命名为苏云金芽胞杆菌(喻子牛，1990)，目前已经有4万多株菌株被分离鉴定。实验证明，苏云金芽胞杆菌对包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲的500多种昆虫具有毒杀作用，另外，它还可以有效地防治原生动物门、线形动物门、扁形动物门、疟原虫、血吸虫、螨类等多种虫害(Schnepf H E,Crickmore N,Rie J V，Lereclus D,Baum J,Feitelson J,Zeigler D R,Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev,62:775-806)，因此苏云金芽胞杆菌被广泛应用与农林业重要害虫的生物防治和转基因抗虫育种，并且保持了近90年的安全使用记录。 

1981年，Schnepf和Whiteley首次从苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种菌株HD-1中分离了第一个杀虫晶体蛋白基因，此后人们陆续发现并鉴定了多个新的杀虫基因，并且将其成功地应用到微生物杀虫剂及转基因作物的领域，因此克隆新的杀虫基因一直是苏云金芽胞杆菌研究领域中的热点。随着新基因数目的增多，Crickmore等学者于1996年正式提出了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白按氨基酸序列同源性进行分类的新的分离系统，规定了命名规则及分类原则。其中cry基因必须是来自苏云金芽胞杆菌，编码伴胞晶体蛋白的杀虫基因；cyt基因是一种编码具有溶细胞活性的伴胞晶体蛋白，并与已知编码Cyt蛋白有明显的序列相似性的基因。根据全长基因推导的氨基酸序列的同源性将杀虫晶体蛋白基因分为四个等级。级与级之间的分类界线为同源性95%、78%和45%(Crickmore N,Zeigler DR,Feitelson J,Schnepf E,van Rie J,Lereclus D,Baum J,Dean DH.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。 

杀虫晶体蛋白是Bt菌株最主要的杀虫物质，目前已有200多个cry基因被鉴定克隆。传统的cry基因的克隆方法主要包括：生物测定法、Southern杂交法、蛋白质测序法、构建文库法、各种PCR技术等，然而上述方法存在费时、费力及特异性差等缺点。申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的叶 伟星博士利用第二代高通量测序技术建立了一种快速鉴定新型cry基因的方法，从而有效地克服了上述缺点，具体方法参见图1及http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner/。