[发明专利]一种木聚糖酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶的提取、应用技术领域，具体涉及一种木聚糖酶及其应用。

背景技术

半纤维素占植物干重的35%，是自然界中含量仅次于纤维素的碳水化合物。与纤维素相比，半纤维素结构与组成十分复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖等多种组分。其中木聚糖是细胞中最具代表性的半纤维素，它可以作为再生资源被人们利用。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，包括内切-β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.8）、外切-β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.92）、β-木糖苷酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.37），另外还包括α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶和苯酚酸脂酶。其中以内切-β-1，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶最为重要，作用于木聚糖主链。狭义上的木聚糖酶仅限于内切-β-1，4-木聚糖酶。内切-β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖和长链木聚糖，从β-1，4-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以产生少量木糖和阿拉伯糖。

自七十年代末，八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。Lapidot(Lapidot A,Mechaly A,Shoham Y.J.of Biotechnology，1996,51:259)等根据一个已知序列的芽孢杆菌木聚糖酶基因，重新设计引物，利用PCR方法克隆起始密码子ATG以后的结构基因(不带前导序列)，转到T-7RNA多聚酶表达载体pET3d上，在IPTG诱导下表达的木聚糖酶高达140U/ml。Jung(Jung KH,PackM Y.Biotechnology Letters,1993,15(2):115-120)等用枯草芽孢杆菌染色体上的强启动子替换热纤维梭菌木聚糖酶基因自身的启动子，并去掉C末端与酶活无关的一段基因序列，把该基因转化到枯草芽孢杆菌中表达，胞外酶活可达30U/ml。Ghangas(Ghangas,G S,Hu,Y J,Wilson,D B.J.Bacteriol.,1989,171(6):2963-2969)等将褐色高温单孢菌的木聚糖酶基因用穿梭质粒转到浅青紫链霉菌中表达，其表达量是在大肠杆菌中表达量的10-20倍，但只有原始菌株表达量的四分之一。Herbers(Herbers K,Wilke I,Sonnewald U.Biotechnology，1995,13:63-66)等将热纤维梭菌的热稳定木聚糖酶基因转到烟草中，产生的木聚糖酶位于烟草的质外体空间，酶的热稳定性及活性都没有丧失而且酶易于提纯。另一例烟草中表达的是粪堆梭菌的木聚糖酶基因，该基因在烟草花叶病毒35S的启动子控制下表达，表达的木聚糖酶大部分在培养液的上清液中，一小部分在细胞内，木聚糖酶蛋白的量占可溶性总蛋白的5%。值得一提的还有Whitehead(Whitehead RT,Hespell B R.FEMS Microbiology Letters,1990,66:61-66)的工作，他们使用大肠杆菌--类菌体穿梭载体将栖瘤胃拟杆菌的木聚糖酶基因接合转移至脆弱拟杆菌和单形拟杆菌中，该基因在这两种菌中都能表达，粗酶液的比活分别是原始菌株的1400倍和1600倍。华中农业大学的张桂敏等采用不同的基因克隆方法分别从短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、真菌Plectosphaerella cucumerina和Verticillium dahlia克隆到三个木聚糖基因，从土壤微生物DNA中克隆到10个木聚糖基因片段，并分别在毕赤酵母进行了高效表达，研究了重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。